FUNCTIONALIZED  2,6-­‐BIS-­‐(2-­‐ANILINOETHYNYL)  PYRIDINE:  ANION-­‐MEDIATED  SELF-­‐ ASSEMBLY  AND  CHEMOSENSING                         by     CALDEN  NATHANIEL  CARROLL  STIMPSON                             A  DISSERTATION     Presented  to  the  Department  of  Chemistry   and  the  Graduate  School  of  the  University  of  Oregon   in  partial  fulfillment  of  the  requirements   for  the  degree  of   Doctor  of  Philosophy       December  2011   ii     DISSERTATION  APPROVAL  PAGE     Student:  Calden  Nathaniel  Carroll  Stimpson     Title:  Functionalized  2,6-­‐Bis-­‐(2-­‐anilinoethynyl)  Pyridine:  Anion-­‐Mediated  Self-­‐Assembly   and  Chemosensing     This  dissertation  has  been  accepted  and  approved  in  partial  fulfillment  of  the   requirements  for  the  Doctor  of  Philosophy  degree  in  the  Department  of  Chemistry  by:     Victoria  DeRose     Chairperson   Michael  Haley     Co-­‐Advisor   Darren  Johnson     Co-­‐Advisor   Shih-­‐Yuan  Liu     Member   David  Schmidt     Outside  Member     and     Kimberly  Andrews  Espy     Vice  President  for  Research  &  Innovation/Dean  of   the  Graduate  School       Original  approval  signatures  are  on  file  with  the  University  of  Oregon  Graduate  School.     Degree  awarded  December  2011   iii                                 ©  2011  Calden  Nathaniel  Carroll  Stimpson   iv     DISSERTATION  ABSTRACT     Calden  Nathaniel  Carroll  Stimpson     Doctor  of  Philosophy     Department  of  Chemistry     December  2011     Title:  Functionalized  2,6-­‐Bis-­‐(anilinoethynyl)  Pyridine:  Anion-­‐Mediated  Self-­‐Assembly   and  Chemosensing     Mimicking  the  simplicity  and  efficiency  of  Nature  in  the  synthesis  and  design  of   non-­‐covalent  receptors  for  ions  in  solution  has  piqued  the  interest  of  the  chemical   community  since  the  mid  20th  century.  Until  recently  most  of  that  focus  has  been  on  the   binding,  sensing,  or  remediation  of  inorganic  cations  instead  of  their  anionic   counterparts.  With  the  realization  of  the  role  anions  play  in  biological  function  or   dysfunction,  the  development  of  selective  probes  for  these  highly  solvated  and  elusive   targets  has  become  an  important  goal  in  the  chemical  and  biological  communities.     Concurrently  the  optoelectronic  properties  of  planar  extended  π-­‐systems  have   been  exploited  in  the  development  of  novel  light  absorbing  and  emitting  organics  and   carbon-­‐rich  materials  with  tunable  optical  outputs.  While  many  of  these  compounds   exhibit  desirable  sensor  properties,  their  insolubility  and  non-­‐specificity  has  hindered   the  inclusion  of  these  materials  in  probes  for  biologically  relevant  substrates.  This  body   of  research  seeks  to  combine  our  knowledge  of  supramolecular  structure-­‐function   relationships  with  novel  extended  aromatic  topologies  to  yield  highly  specific  probes  for   anions  in  competitive  media  that  exhibit  discrete,  tunable  outputs  upon  interaction  with   their  target  substrates.   v       Chapter  I  provides  a  brief  overview  of  phenylacetylene  topologies  as  they  have   been  used  in  supramolecular  assemblies  and  sensor  design,  with  an  emphasis  on  their   use  in  anion-­‐directed  complexes.  Chapter  II  focuses  on  our  choice  of  specific   arylethynylpyridine  architectures  upon  which  we  can  build  a  modular  synthetic  scheme   to  access  working  receptors.  Chapter  III  encompasses  the  synthesis  of  urea  and   sulfonamide  derivatives  of    phenylethynylpyridine  and  binding  studies  with  these   receptors  and  halide  salts  in  organic  media  .  Chapters  IV  and  V  focus  upon  the   optoelectronic  properties  of  these  receptors,  the  tunability  of  their  outputs  and  how  we   utilized  their  behavior  in  aqueous  media  to  develop  in  vitro  sensors  for  halides.  This   chapter  concludes  with  recent  results  regarding  their  self-­‐assembly  on  the  micro-­‐scale.     This  dissertation  contains  my  previously  published  and  co-­‐authored  work.       vi     CURRICULUM  VITAE     NAME  OF  AUTHOR:    Calden  Nathaniel  Carroll  Stimpson       GRADUATE  AND  UNDERGRADUATE  SCHOOLS  ATTENDED:       University  of  Oregon,  Eugene,  OR     Northern  Arizona  University,  Flagstaff,  AZ           DEGREES  AWARDED:       Doctor  of  Philosophy,  2011,  University  of  Oregon     Master  of  Science,  Organic  Chemistry,  2008,  University  of  Oregon     Bachelor  of  Science,  Chemistry,  2005,  Northern  Arizona  University         AREAS  OF  SPECIAL  INTEREST:       Organic  Synthesis     Supramolecular  Self-­‐assembly     Fluorescence  Analysis  and  Microscopy           PROFESSIONAL  EXPERIENCE:       Graduate  Research  Assistant,  Department  of  Chemistry,  University  of  Oregon,   Eugene,  Oregon,  2006-­‐2011       Graduate  Teaching  Assistant,  Department  of  Chemistry,  University  of  Oregon,   Eugene,  Oregon,  2006-­‐2010       Undergraduate  Research  Assistant,  Department  of  Chemistry  and  Biochemistry,   Northern  Arizona  University,  Flagstaff,  Arizona,  2003-­‐2005       GRANTS,  AWARDS,  AND  HONORS:       National  Science  Foundation  IGERT  Fellowship,  University  of  Oregon,  2008-­‐2011     vii       Japan  Society  for  the  Promotion  of  Science  International  Scholarship,  Osaka   University,  2008       American  Chemical  Society  Division  of  Inorganic  Chemistry  Grant  for  the  235th   ACS  National  Meeting,  New  Orleans,  Louisiana  2007       Northern  Arizona  Physical  Chemistry  Award,  Northern  Arizona  University,  2005       PUBLICATIONS:       J.  M.  Engle,  C.  N.  Carroll,  L.  N.  Zakharov,  D.  W.  Johnson  and  M.  M.  Haley,  Chem.   Sci.,  submitted  for  publication.     Y.  Yang,  X.  Su,  C.  N.  Carroll  and  I.  Aprahamian,  Chem.  Sci.,  DOI:     10.1039/C1SC00658D.         J.  M.  Engle,  P.  Lakshminarayanan,  C.  N.  Carroll,  L.  N.  Zakharov,  M.  M.  Haley  and   D.  W.  Johnson,  Cryst.  Growth  Des.,  2011,  11,  5144-­‐5152.       C.  N.  Carroll,  B.  A.  Coombs,  S.  P.  McClintock,  C.  A.  Johnson,  O.  B.  Berryman,  D.  W.   Johnson,  M.  M.  Haley,  Chem.  Commun,  2011,  47,  5539-­‐5541.       C.  N.  Carroll,  J.  J.  Naleway,  M.  M.  Haley  and  D.  W.  Johnson,  Chem.  Soc.  Rev.,   2010,  39,  3875-­‐3888.       C.  N.  Carroll,  O.  B.  Berryman,  C.  A.  Johnson,  L.  N.  Zakharov,  D.  W.  Johnson,  M.  M.   Haley,  Chem.  Commun.,  2009,  2520-­‐2522       R.  Helburn,  M.  Bartoli,  K.  Pohaku,  J.  Maxka,  D.  Compton,  B.  Creedon  and   C.Stimpson,  J.  Phys.  Org.  Chem.,  2007,  20,  321-­‐331.     viii     ACKNOWLEDGMENTS       ix                   This  dissertation  is  dedicated  to  the  Calibri  typeface,  for  all  its  help  in  making  the   contents  appear  as  boring  as  possible.                                                     x     TABLE  OF  CONTENTS   Chapter   Page       I.  ARYLETHYNYL  RECEPTORS  FOR  NEUTRAL  AND  ANIONIC       SPECIES:  EMERGING  APPLICATIONS  ...............................................................     1       General  Introduction  ............................................................................................     1     Impetus  for  Arylethynyl  Receptor  Development  ..................................................     2       Approaches  to  Receptor  Design:  Strategies  and  Methods  ...................................     8     Modularity  in  Synthesis  ..................................................................................     10     Switchability  in  Selectivity  or  Sensitivity  .........................................................     11     Tuning  Receptors  for  Anionic  Targets  ...................................................................     13       Common  Functional  Groups  for  Targeting  Anions  ..........................................     15     Biological  Applications  for  Phenylacetylene-­‐based         Sensors  ............................................................................................................     23       Conclusions  ...........................................................................................................     29     Bridge  to  Chapter  II  ...............................................................................................     30     II.  SYNTHESIS  OF  FIRST  GENERATION  RECEPTORS  AND  PROOF  OF  PRINCIPLE  ...........     31         Introduction  ..........................................................................................................     31     The  Parent  Dianiline  Scaffold  ................................................................................     33     Functionalized  Phenylethynylpyridines:       Synthesis  and  Metal  Binding  Properties  .........................................................     36     Amides:  α-­‐Mercaptoamide  .............................................................................     37       Ion  Binding  ................................................................................................     42     Amides:  Salicylamide  ......................................................................................     44   xi     Chapter   Page         Ion  Binding  ................................................................................................     47     Conclusions  ...........................................................................................................     50     Experimental  .........................................................................................................     51     Bridge  to  Chapter  III  ..............................................................................................     57   III.  ANION  BINDING:  SELECTIVITY  AND  EFFECTS  ON         SOLID-­‐STATE  CONFORMATION  .......................................................................     58     Introduction  ..........................................................................................................     58     Sulfonamides  ........................................................................................................     60     Ureas  .....................................................................................................................     65     Conclusions  ...........................................................................................................     70     Experimental  .........................................................................................................     71     Bridge  to  Chapter  IV  ..............................................................................................     75   IV.  ANION-­‐DEPENDENT,  SWITCHABLE  ON-­‐OFF  AND  OFF-­‐ON  FLUORESCENCE         EMISSION  IN      BIS(ANILINOETHYNYL)PYRIDINE  DERIVATIVES  .........................     76     Introduction  ..........................................................................................................     76     Effects  of  Electronic  Modulation  on  Fluorescence  Emission  ................................     79       Calculations  .....................................................................................................     83     Further  Functionalization  of  Urea  Receptors  ........................................................     83     Mechanistic  Investigation  of  the  “OFF-­‐ON”  Response  .........................................     87       Self-­‐association  in  Ureas  .................................................................................     89         Methoxyphenylurea  3a  ..............................................................................     89         Nitrophenylurea  3b  ....................................................................................     93   xii     Chapter   Page         Summary  .........................................................................................................     95       Fluorescence  Experiments  ..............................................................................     96         Methoxyphenylurea  3a  ..............................................................................     96         Nitrophenylurea  3b  ....................................................................................     98           Fluorescence  Lifetimes  ...........................................................................     100     Conclusion  .............................................................................................................     103     Experimental  .........................................................................................................     104     Bridge  to  Chapter  V  ...............................................................................................     108   V.  FUNCTIONALIZED  ANILINOETHYNYLPYRIDINE  UREAS:  IN  VITRO  IMAGING       AND  ANION  MEDIATED  SELF-­‐ASSEMBLY  ........................................................     110     Introduction  ..........................................................................................................     110     A.  Cellular  Imaging  of  Inorganic  Anions  ................................................................     112       Fluorescence  in  Vesicles  .................................................................................     117       Aggregation  Induced  Emission  in  Aqueous  Media  ..........................................     119     B.  Anion-­‐induced  Supramolecular  Assemblies  of  Other  Urea  Receptors  .............     123       Anion-­‐dependent  Fluorescent  Aggregates  .....................................................     124       Transmission  Electron  Microscopy  .................................................................     126       Circular  Dichroism  ...........................................................................................     132     Conclusions  ...........................................................................................................     139     Experimental  .........................................................................................................     140   VI.  CONCLUDING  SUMMARY  ......................................................................................     146   xiii     Chapter   Page     APPENDICES  ................................................................................................................     149     A.  SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  II:  SYNTHESIS  OF  FIRST       GENERATION  DERIVATIVES  AND  PROOF  OF  PRINCIPLE  ..................................     149       B.  SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  III:  ANION  BINDING:         SELECTIVITY  AND  EFFECTS  ON  SOLID-­‐STATE  CONFORMATION  ......................     151       C.  SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  IV:  ANION-­‐DEPENDENT,     SWITCHABLE  ON-­‐OFF  AND  OFF-­‐ON  FLUORESCENCE  EMISSION  IN       BIS(ANILINOETHYNYL)PYRIDINE  DERIVATIVES  ................................................     168       D.  SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  V:  FUNCTIONALIZED     ANILINOETHYNYLPYRIDINE  UREAS:  IN  VITRO  IMAGING  AND  ANION-­‐   MEDIATED  SELF-­‐ASSEMBLY  .............................................................................     178       REFERENCES  CITED  .....................................................................................................     187   xiv     LIST  OF  FIGURES     Figure   Page       CHAPTER  I     1.   Representative  examples  of  early  acetylene  and  diethynylene  scaffolds  ............     4     2.   Glucopyranoside  receptor  4  and  the  non-­‐conjugated  analog  5  used  to       test  the  role  of  rigidification  versus  electronic  perturbation  upon       binding  analytes.  ...................................................................................................     5     3.   Cleft  receptor  6a  and  macrocyclized  receptor  6b  used       to  demonstrate  the  benefit  of  macrocyclization  ..................................................     6     4.   Phosphorylated  macrocycles  used  to  illustrate  the  importance  of  size       regulation  in  tuning  the  binding  interaction  with  desired  guests  .........................     7     5.   Monomer  (9)  of  a  β-­‐glucoside  binding  polymer.  ..................................................     8     6.   Example  of  a  typical  tripodal  dye-­‐displacement       receptor  ................................................................................................................     9     7.   Macrocyclic  and  acyclic  receptors  11-­‐13b  illustrate  the  influence  of       small  changes  to  H-­‐bonding  character  on  binding  affinities  .................................     12     8.   Bicyclic  14  illustrating  the  effect  incremental  increases  in  binding       pocket  size  can  have  on  binding  strength  .............................................................     16     9.   The  consequences  of  overly  restricting  the  degrees  of  freedom     in  a  receptor  (15-­‐18)  .............................................................................................     17     10.  Macrocycle  19  and  cleft  receptor  20  in  both  “H-­‐bond  accepting”  and       “H-­‐bond  donating”  binding  modes  .......................................................................     18     11.  Tripodal  alkyne  containing  receptor  21  and  22  ....................................................     19     12.  Fluorescent  “turn-­‐on”  sensors  for  Cl-­‐  23a,b  and  the  model  compound  24       used  to  determine  the  conformational  dependence  of  the  fluorescence     emission  ................................................................................................................     20         xv     Figure   Page     13.  Allosteric  receptor  25  exhibited  no  cooperativity  with  smaller  guests,     i.e.,  Cl-­‐,  but  cooperative  binding  for  Br-­‐  and  larger  oxoanions  ..............................     21     14.  Monomeric  26  and  polymeric  27  both  bound  guests  in  the  typical       Hofmeister  fashion,  but  polymerization  increased  the  binding  34-­‐fold  ...............     22     15.  Two-­‐photon  absorbing  phenylacetylene  28  .........................................................     23     16.  The  structure  of  the  Cl-­‐  sensitive  moiety  of  the  in  vitro  functional       fluorogenic  probe  33  ............................................................................................     25     17.  First  generation  inhibitors  34a,b  were  improved  by  including  the  ethynyl       bridge  in  34c  .........................................................................................................     26     18.  Coronal,  axial  and  sagittal  PET  images  of  derivatives  of  35  ..................................     27     19.  PET-­‐imaging  agents  designed  to  bind  Aß  plaques  ................................................     28     20.  G-­‐quadruplex  DNA  binding  anilinoethynylpyridine  37  made  water  soluble  ........     29       CHAPTER  II     1.  Macrocycle  1  and  platinacycle  2  .............................................................................     31     2.  Ethynylarene  scaffolds  for  three-­‐coordinate  receptors  ..........................................     32     3.  UV-­‐Vis  absorbance  spectra  of  3,  3•TFA,  and  3•HCl  in  chloroform.  ........................     34     4.  Fluorescence  excitation  and  emission  spectra  for  3  and  its  TFA  and  HCl  salts  in     chloroform.  .............................................................................................................     35     5.  ORTEP  representation  of  11  with  thermal  ellipsoids  drawn  at  the  50%       probability  level  ......................................................................................................     40     6.  ORTEP  representations  of  11·∙Hg(II)  with  thermal  ellipsoids  drawn  at  the       50%  probability  level.  .............................................................................................     42     7.  Excitation  and  emission  spectra  of  11,  11·∙Hg(II)  and  12  (excitation  at       335  nm)  in  chloroform  ...........................................................................................     43     8.  UV-­‐Vis  data  for  13  and  13·∙TFA  in  acetonitrile.  ........................................................     45   xvi     Figure   Page     9.  Fluorescence  emission  of  13  in  neutral  and  protonated  states  in  acetonitrile  ......     46     10.  ORTEP  representations  of  13  with  thermal  ellipsoids  drawn  at  the       50%  probability  level  ..............................................................................................     46     11.  UV-­‐Vis  spectra  of  solutions  of  13  at  28  µM  (blue  trace),  with  TFA  (red  trace)       and  with  TEA  (orange  trace)  ...................................................................................     48     12.  UV-­‐Vis  spectra  of  13  at  29uM  in  MeCN  titrated  with  Zn(NO3)2  in  the  presence       of  TEA  (a)  to  1.5  equivs  (b)  to  5  equivs  ...................................................................     48     13.  Correlation  between  equivalents  of  Zn(NO3)2  added  to  13  in  MeCn  and  the       absorbance  change  in  the  UV-­‐Vis  spectrum  monitored  at  400  nm.  ......................     49       CHAPTER  III     1.  Illustrations  of  the  dimerization  of  2c  .....................................................................     62     2.  Isotherm  generated  from  plotting  the  absorbance  at  400  nm  in  a  29.1  µM       solution  of  2e  with  tetrabutylammonium  bromide  in  CHCl3  ..................................     64     3.  ORTEP  representation  (50%  probability  ellipsoids)  of  the  two  conformers       of  3a·∙MeOH  with  two  solven  molecules  in  different  H-­‐bonding  motifs  .................     66     4.  Top  (left)  and  side  (right)  views  of  the  DFT  calculated  position  of  the       trifluoroacetate  anion  in  protonated  3a  ................................................................     67     5.  ORTEP  representation  of  the  protonated  receptor  3a·∙HCl  .....................................     69       CHAPTER  IV     1.  Structures  of  2,6-­‐bis(2-­‐anilinoethynyl)pyridine  receptor  core  1,       urea  (2-­‐3b)  and  sulfonamide  (4a,b)  derivatives  .....................................................     78     2.  UV-­‐Vis  spectra  of  1  and  2a  as  both  protonated  and  neutral  receptors      ([H]  or  [H+]  =  12µM)  ...............................................................................................     79     3.  Normalized  emission  spectra  of  both  the  neutral  and  protonated      electron-­‐rich  receptors  ..........................................................................................     80     xvii     Figure   Page     4.  Normalized  emission  of  electron-­‐poor  receptors  both  neutral  and       protonated  with  TFA  or  HCl  ....................................................................................     80     5.  Colorless  solutions  of  neutral  compounds  in  CHCl3  turn  yellow       upon  protonation  ...................................................................................................     82     6.  Calculated  frontier  molecular  orbitals  for  neutral  ureas  3a,b  and       sulfonamides  4a,b  ..................................................................................................     84     7.  Normalized  mission  of  electron-­‐rich  receptor  3c  and  its  TFA  and       HCl  salts  along  with  the  alkylated  receptor  3f  and  its  TFA  and  HCl  salts  ................     85     8.  Normalized  emission  spectra  of  electron-­‐poor  analogs  .........................................     86     9.  1H-­‐NMR  projection  and  2-­‐D  ROESY  spectrum  of  3a  at  3.4  mM  ..............................     90     10.  2D-­‐DOSY  spectrum  of  3a  showing  the  average  diffusion  coefficient       used  to  calculate  the  molecular  mass  relative  to  the  internal  standard  (TMS)  .....     91     11.  ESI-­‐MS  spectrum  of  3a·∙TFA  from  hexanes  ............................................................     92     12.  ORTEP  representations  of  3b  ................................................................................     93     13.  Representative  2D-­‐DOSY  spectrum  of  3b·∙TFA  in  CDCl3  illustrating       the  broad,  ill-­‐defined  diffusion  coefficients  and  speciation  in  solution  .................     94     14.  ESI-­‐MS  spectrum  of  3b·∙TFA  from  hexanes  ............................................................     95     15.  Fluorescence  emission  of  3a  (16.9  µM,  CHCl3)  as  the  freebase,  in  the       presence  of  1  equiv  of  TFA-­‐protonated  3a,  and  1  equivalent  of       N-­‐methylpyridinium  tetrafluoroborate  ..................................................................     97     16.  UV-­‐Vis  absorbance  spectra  for  the  switching  of  3b·∙TFA  in  100%  CHCl3       to  0%  CHCl3  in  MeCN  at  7.1  µM  ..............................................................................     98     17.  Fluroescence  emission  spectra  of  the  7.1  µM  solutions  of  3b·∙TFA  from       Figure  16  upon  solvent  switching  from  100%  CHCl3  to  0%  CHCl3  in  MeCN  ............     99     18.  TCSPC  fitting  of  decay  data  for  (a)  3f  in  CHCl3  and  (b)  3f·∙HCl  at  8µM  ...................     101     19.  TCSPC  fitting  of  decay  data  for  3b·∙HCl  in  CHCl3  at  8µM  .......................................     102     xviii     Figure   Page     CHAPTER  V     1.  Receptors  used  in  cellular  assays  ............................................................................     112     2.  Epifluorescence  image  of  NIH3t3  mouse  embryo  fibroblasts  incubated       with  a  7.4  pH  buffered,  high  Cl-­‐  solution  and  stained  with  1a·∙TFA  at  50µM  ..........     113     3.  Nomarski  phase  contrast  image  of  1a  ....................................................................     115     4.  Fluorescence  emission  spectra  of  vesicle  solutions  containing  1a·∙TFA  ..................     118     5.  Fluorescence  emission  data  for  aggregation  experiments  .....................................     121     6.  Fluorescence  of  1a·∙TFA  in  DMSO  injected  into  DMSO  (blue  trace),      high  Cl-­‐  buffered  H2O  (red  trace)  and  H2O  buffered  with  no  Cl-­‐  content       (green  trace)  ...........................................................................................................     122     7.  Top:  solutions  of  1b•HBF4  with  TBAX  in  acetonitrile,       bottom:  under  365  nm  light  ...................................................................................     124     8.  Fluorescence  emission  of  1b·∙HBF4  with  TBANO3  in  the  solid  state  .........................     125     9.    TEM  images  of  1b·∙HBF4  on  lacy  carbon  (scale  bar  inset  .........................................     126     10.  TEM  images  of  1b·∙HBF4  after  exposure  ................................................................     127     11.  TEM  images  of  1b·∙HBF4  exposed  to  TBACl  ............................................................     128     12.  TEM  image  of  1b·∙HBF4  after  exposure  to  TBABr  ...................................................     129     13.  TEM  images  illustrating  the  striated  pattern  in  the  rods  ......................................     130     14.  ORTEP  representation  (thermal  ellipsoids  at  the  50%  probability  level)  of  the       crystal  structure  of  1b  grown  from  MeCN  .............................................................     131     15.  (Left)  CD  spectra  of  4  with  decreasing  concentration  (start:  7  µM       final:  0.5  µM);  (right)  CD  spectra  of  4  with  increasing  TBACl  concentration  ..........     135     16.  CD  spectra  of  4  during  titration  of  TFA  in  CHCl3  ...................................................     137     17.  MM3  minimized  model  of  the  simplest  chiral  conformation  of  the       arylethynyl  pyridine  scaffold  in  4  ...........................................................................     138   xix     Figure                                                                                                                                                                                                                                                                                    Page     18.  Comparison  of  4,  4·∙TFA  and  4·∙TFA  with  a  slight  excess  of  TBACl  .........................     139         xx     LIST  OF  TABLES     Table   Page     CHAPTER  III     1.   Calculated  Ka  (M-­‐1)  fit  to  a  [1  +  1]  model.12  Average  values  from  triplicate      measurements  are  shown  ...................................................................................     68       CHAPTER  IV     1.     Absolute  photoluminescent  quantum  yields  of  the  freebase  and  protonated       Receptors  ..............................................................................................................     82     2.   Evidence  of  self-­‐association  (“Y”)  or  no  evidence  of  self-­‐association  (“N”)      in  urea  3a  and  3b  .................................................................................................     96     3.   Biexponential  fitting  data  for  3f,  3f·∙HCl  and  3b·∙HCl.  The  ratios  of  each       lifetime  are  representative  of  the  relative  percent  of  the  population  of       fluorescing  species  in  solution  ..............................................................................     102       CHAPTER  V     1.   Summary  of  epifluorescence  results  .....................................................................     114     2.   Binding  constants  for  1a  and  1a·∙TFA  in  water  saturated  CHCl3  with       tetrabutylammonium  salts  of  chloride  and  nitrate  ..............................................     115     3.   Cell  viability  upon  treatment  with  the  receptor  and  saline  solutions,       and  10%  DMSO  .....................................................................................................     116     xxi     LIST  OF  SCHEMES     Scheme   Page     Chapter  II     1.   Retrosynthesis  of  parent  scaffold..  .......................................................................     33     2.   Synthesis  of  dianiline  3  .........................................................................................     34     3.   Synthesis  of  7  and  attempted  synthesis  of  6  ........................................................     37   4.   Synthesis  of  thioketal  9  .........................................................................................     38   5.   Synthesis  of  11  and  12  ..........................................................................................     39   6.   Reagents  and  conditions:  (a)  salicylic  acid,  DCC,  HOSu,  DMAP,  DIEA,  DCM,       (b)  salicylic  acid,  BOP•PF6,  TEA,  DCM  ...................................................................     44       Chapter  III     1.   Sulfonamide  and  urea  synthesis  ...........................................................................     60   2.   Synthesis  of  new  sulfonamide  receptors  2e,f  .......................................................     63   3.   Synthesis  of  new  urea  analogs  for  ongoing  membrane  transport  studies  ...........     65     Chapter  IV   1.   Synthesis  of  additional  electron-­‐rich  and  electron-­‐poor  receptors  ......................     85     Chapter  V   1.   Synthesis  of  chiral  urea  compounds  4,  8  and  12  ..................................................     133     1           CHAPTER  I     ARYLETHYNYL  RECEPTORS  FOR  NEUTRAL  AND  ANIONIC  SPECIES:  EMERGING   APPLICATIONS     General  Introduction       The  unifying  theme  of  the  work  presented  herein  is  the  application  of  shape   persistent,  semi-­‐rigid  arylethynyl  compounds  for  fluorometric  or  colorimetric  sensing   (e.g.,  of  anions  or  redox  states)  in  competitive  media,  specifically  working  towards  in   vitro  applications.  This  introduction  provides  a  brief,  non-­‐comprehensive  overview  of   previously  reported  research  that  has  made  successful  use  of  the  rigidity  and  extension   of  molecular  conjugation  afforded  by  the  inclusion  of  ethynyl  linkages  to  supramolecular   assemblies,  and  outlines  the  design  elements  and  benefits  imparted  by  the  inclusion  of   these  rigid  moieties.  My  contribution  to  an  invited  review  article  in  a  special  issue  of   Chemical  Society  Reviews  dedicated  to  anion  binding  is  included  (2010,  39,  3875-­‐3888,   ©  Royal  Society  of  Chemistry).  This  chapter  was  co-­‐authored  with  Dr.  John  J.  Naleway,   who  provided  editorial  assistance  in  the  cellular  imaging  section,  and  my  advisors,  Profs.   Michael  M.  Haley  and  Darren  W.  Johnson.  Chapter  II  will  detail  some  of  the  preliminary   metal-­‐binding  experiments  undertaken  with  the  help  of  Dr.  Charles  Johnson  and  Dr.   Orion  Berryman,  who  carried  out  the  synthesis  of  the  sulfonamide  compounds  and  their   crystallographic  analyses,  respectively.  Daisuke  Inokuchi  synthesized  the  dithiols   2     presented  therein.  Chapter  III  will  focus  on  the  synthesis  and  binding  studies  of  the   parent  scaffold  and  its  phenylurea  derivative.  This  chapter  was  coauthored  with  Dr.   Charles  Johnson,  Dr.  Orion  Berryman  and  my  advisors,  all  of  whom  provided  editorial   assistance.    Dr.  Sean  McClintock  performed  the  molecular  modeling  reported  therein.   Chapter  IV  presents  the  tunable  fluorescence  data  that  was  collected  on  the  electron-­‐ rich  and  electron-­‐poor  urea  receptors.  This  chapter  was  coauthored  with  a  number  of   people:  Brian  Coombs  assisted  with  the  synthesis  and  analysis  of  these  compounds   while  Dr.  Sean  McClintock  performed  the  DFT  calculations  supporting  our  experimental   observations;  Dr.  Charles  Johnson  and  Dr.  Orion  Berryman,  as  well  as  my  advisors,   provided  editorial  assistance  and  direction  on  the  submitted  manuscript.  Finally,   Chapter  V  focuses  on  the  in  vitro  imaging  applications  and  the  self-­‐assembly  of  the  urea   receptors  in  both  aqueous  and  organic  media.  This  chapter  was  coauthored  with  Dr.   John  Naleway  (Marker  Gene,  Inc.)  who  provided  epifluorescence  images.  Dr.  Matthew   Carnes  who  assisted  in  designing  the  circular  dichroism  experiments.  This  chapter  is   followed  by  brief  concluding  remarks.     Impetus  for  Arylethynyl  Receptor  Development         Many  synthetic  receptors  rely  on  some  degree  of  preorganization  in  their   approach  to  achieving  high  affinities  and  selectivities.  Flexible  receptors  can  achieve   increased  size-­‐selectivity  and  preorganization  through  macrocyclization,  and   numerous,  in-­‐depth  reviews  have  been  written  which  cover  the  usefulness  of  the   macrocyclic  effect  in  increasing  binding  affinities.1-­‐4  However,  macrocyclic  receptors   3     tend  to  exhibit  slow  binding  kinetics1,2  and    indeed  many  sensor  applications  rely   more  upon  kinetic  selectivity  rather  than  a  large  contribution  from  preorganization   of  the  receptor.  In  addition  it  can  be  the  case  that  the  guest  bound  most  strongly  is   not  the  guest  that  gives  rise  to  the  largest  colorimetric  or  fluorometric  response,   which  is  difficult  to  predict.  This  gives  rise  to  a  delicate  balance  in  designing  probes   capable  of  binding  a  target  selectively,  while  also  exhibiting  a  response  for  that   specific  analyte.   There  exist  many  examples  of  conformationally  rigid  receptors,5-­‐7  most  of  which   exploit  the  inherent  rigidity  in  conjugated  π-­‐systems.  Expanded  porphyrins,8,9   calixpyrroles  or  related  calixarenes,10-­‐12  and  innumerable  other  nitrogen13,14  or  oxygen   containing  heterocycles15  have  been  synthesized  and  their  affinities  for  both  ionic  and   neutral  guests  studied.  In  much  the  same  fashion  phenylacetylenes  have  provided   structure  and  optoelectronic  handles  to  a  multitude  of  coordination  and  host-­‐guest   complexes.16  Macrocyclic  host  molecules  as  well  as  shape-­‐persistent  acyclic  ligands  for   metal  ions  have  benefited  from  their  linear,  rigid  geometries  and  relatively  simple   derivatization.17-­‐20   In  some  cases  the  acetylenes  themselves  have  served  as  the  binding  site  for   transition  metal  guests.21  The  synthesis  and  characterization  of  a  Ni0  complex  of   dehydroannulene  1  was  reported  in  1985  (Figure  1).22  More  often,  however,  the  rigid   acetylenic  linker  serves  to  reinforce  a  desired  binding  conformation.  The  synthesis  and   characterization  of  phenylacetylenic  macrocycles  capable  of  differentiating  transition   metals  as  well  as  serving  as  rudimentary  proton  sensors  has  also  been  achieved.23-­‐25   4     Twistophane  2  was  shown  to  signal  PdII  and  HgII  by  a  distinct  fluorescence  quenching   response,  and  to  signal  H+  by  bathochromic  shifting  and  quenching  of  the  fluorescence   emission.23     NN N N                     Figure  1.  Representative  examples  of  early  acetylene  (1,2)  and  diethynylene  (2,3)   scaffolds.         Phenylacetylenes  have  well-­‐studied  fluorescence  emission  properties,26,27  and   the  optoelectronic  response  to  perturbation  of  their  ground-­‐state  conformations  can  be   a  useful  spectroscopic  handle.  The  conjugation  of  donor  and  acceptor  groups  via  alkyne   linkages28  is  much  studied  and  this  charge  transfer  process  has  been  used  as  a   fluorescent  handle  for  the  visualization  of  binding  events.29  Dibutylamine-­‐functionalized   dehydrobenzoannulene  3  was  found  to  shift  fluorescence  emission  based  upon  H+   concentration  (as  trifluoroacetic  acid).  Interestingly,  it  was  found  that  emission  shifting   was  dependent  upon  stepwise  protonation  of  the  dibutylaniline  moieties,  which   indicated  independent  manipulation  of  the  frontier  molecular  orbital  energies  and  thus   tunable  charge  transfer  pathways.         In  2002  ethynyl-­‐linked  pyrrole-­‐naphthyridine  compound  4  was  found  to   selectively  bind  glucopyranoside  (Figure  2).30  The  free  receptor  was  found  to  adopt  a   1 2 3 NBu2Bu2N Bu2N NBu2 5     slightly  twisted  conformation  that  exhibited  a  fluorescence  emission  maximum  at   475  nm  (τf  ≈  1.25  ns),  which  decreased  upon  addition  of  octyl  β-­‐D-­‐glucopyranoside   (OGU).  A  new  emission  band  at  535  nm  (τf  ≈  0.95  ns)  grew  in  intensity  as  a  1:1   complex  was  formed.  The  association  constants  for  this  complex  determined  by  both   fluorescence  and  UV-­‐Vis  absorbance  measurements  were  in  good  agreement  (Ka  =   5.3  x  103  M-­‐1  and  Ka  =  4.8  x  103  M-­‐1  in  CH2Cl2,  respectively).  Interestingly,  the   association  constant  for  octyl  β-­‐D-­‐galactopyranoside  was  found  to  be  only  1800  M-­‐1,   which  is  impressive  considering  these  saccharides  differ  only  in  the  orientation  of   the  4-­‐hydroxyl  group.  The  optoelectronic  response  in  this  system  was  attributed  to  a   rigidification  and  planarization  of  the  pyrrole-­‐naphthyridine  moieties,  which  served   to  enhance  the  charge  transfer  in  this  D-­‐π-­‐A-­‐A-­‐π-­‐D  system.     N N NH HN     N N OH OH     Figure  2.  Glucopyranoside  receptor  4  and  the  non-­‐conjugated  analog  5  which  was  used   to  test  the  role  of  rigidification  versus  electronic  perturbation  upon  binding  analytes.         To  test  this,  an  analogous  receptor  5  was  synthesized  in  which  the  binding   sites  were  not  conjugated  through  the  core.  Binding  of  OGU  to  this  receptor  was   weaker  due  to  the  relative  differences  in  acidity  at  the  binding  sites,  but   fluorescence  emission  intensity  still  increased,  albeit  not  bathochromically  shifted  as   could  be  expected  by  rigidification  in  this  system.  Additionally,  modification  of  the   4 5 6     pyrrolyl  moieties  of  4  to  indolyl  units  gave  the  normally  CD-­‐silent  receptor  strong   fluorescence-­‐detected  CD  spectra  upon  binding,  due  to  chirality  transfer  from  the   substrates.31       A  simple  illustration  of  how  flexible  macrocyclization  of  rigid  arylethynyl   scaffolds  can  increase  binding  constants  is  found  in  two  pyridine  based  systems  6a  and   6b  (Figure  3).32  Acyclic  6a  bound  ribofuranosides  poorly  in  CDCl3  (Ka  =  30  M-­‐1)  but   macrocyclization  of  this  cleft-­‐like  receptor  increased  binding  constants  two  orders  of   magnitude  (Ka  =  2400  M-­‐1).  Related  poly(ethyleneglycol)  linked  derivatives  of  this   receptor  motif  allowed  the  expanded  terpyridine  core  to  adopt  a  slightly  wider   conformation  while  maintaining  preorganization.32a  Due  to  this  longer,  more  flexible   linker  these  receptors  exhibited  still  higher  affinities  for  larger  monosaccharides.   N N N NH HN OO R R                                         Figure  3.    Cleft-­‐receptor  6a  and  macrocyclized  receptor  6b  used  to  demonstrate  the   benefit  of  macrocyclization,  even  in  receptors  with  a  rigid  scaffold.         A  number  of  phosphorylated  binol-­‐based  macrocycles  have  been  investigated   as  receptors  for  neutral  guests,  such  as  saccharides.33-­‐35  The  polyanionic  cavities  in   receptors  7a  and  7b  were  targeted  at  the  hydroxyl  moieties  of  the  sugars,  a  strategy   which  proved  effective  even  in  slightly  competitive  media  (Figure  4).  It  was  found   6a: R = C10H21 6b: R = 7     that  macrocyclization  can  be  a  hindrance  in  these  very  rigid  systems;  cyclotrimer  7a   was  found  to  be  incapable  of  binding  monosaccharides  in  the  cavity,  but  was  still   capable  of  binding  OGU  (Ka  =  3500  M-­‐1  in  CD3CN)  ostensibly  through  a  face-­‐to-­‐face   interaction.34  However,  cyclotetramer  7b  was  large  enough  to  bind  pyranose  in  its   cavity,  with  a  corresponding  increase  in  association  constant  (Ka  =  4500  M-­‐1  for   OGU),  while  extended  cyclotetramer  8  was  selective  for  disaccharides  over   monosaccharides  even  in  very  competitive  media  (Ka  of  10,700  –  12,500  M-­‐1  in  88:12   CD3CN-­‐CD3OD).35  The  rigidity  of  the  macrocyles  in  these  cases  helped  to  reinforce   their  size  selectivity  between  guests.     O O BnO BnO P O O O O OBn OBn P O O O O OBn OBn P O O O O BnO BnO P O O n                       O O BnO BnO P O O O O OBn OBn P O O O O BnO BnO P O O O O OBn OBn P O O     Figure  4.    Phosphorylated  macrocycles  used  to  illustrate  the  importance  of  size   regulation  in  tuning  the  binding  interaction  with  desired  guests.         This  size  regulation  can  also  be  extended  to  polymers  of  phenylacetylenic   subunits.  Polymers  of  9  were  found  to  exhibit  saccharide-­‐dependent  induction  of   7a: n = 0 7b: n = 1 8 8     chirality  (Figure  5).36  Hydrogen  bonding  with  saccharide  guests  was  reinforced  by  the   rigidity  and  relative  angle  of  the  alkyne  linkers  between  pyridine  units,  which   necessarily  directed  all  of  the  hydrogen-­‐bond  accepting  lone  pairs  to  the  interior  of   the  cavity.  This  reinforcement  also  biased  the  polymer  for  the  2,3,4,6-­‐OH  groups  of   β-­‐glucoside  from  other  monosaccharides  or  their  derivatives.  The  above  examples,   while  by  no  means  exhaustive,  illustrate  a  few  of  the  design  strategies  involved  in   engineering  a  selective  and  sensitive  fluorescent  probe,  and  how  phenylacetylenes   offer  one  such  viable  design  pathway.                       Figure  5.    Monomer  (9)  of  a  β-­‐glucoside  binding  polymer.     Approaches  to  Receptor  Design:  Strategies  and  Methods       A  viable  non-­‐covalent  receptor  must  strike  a  balance  between  selectivity,   solubility,  robustness  and,  in  the  case  of  sensors,  signalling  or  response.1-­‐3  There  are   a  few  distinct  strategies  for  designing  effective  non-­‐covalent,  fluorionophores.  These   can  be  classified  simply  as  either  “FSR”  (fluorophore-­‐spacer-­‐receptor)  or   displacement.37-­‐39       In  the  FSR  system,  an  independently  tunable  binding  site  is  linked  covalently   to  a  signalling  unit.  The  role  of  the  signalling  unit  is  simply  to  transduce  the  chemical   NI H n 9 9     information  upon  coordination  from  the  binding  site  into  a  specific  fluorescent   response.  This  historically  has  been  the  most  common  approach  to  engineering   fluorogenic  hosts  to  complex  ionic  targets,  and  many  reviews  exist.37,39  There  has   been  considerable  success  with  what  could  be  called  a  noncovalent  version  of  FSR.38   This  dye-­‐displacement  method  relies  upon  careful  modulation  of  a  bound   fluorophore  or  chromophore  that  is  designed  to  have  a  weaker  affinity  for  the  host   than  the  target  analyte.         In  1998  there  was  reported  the  synthesis  of  the  hexa-­‐substituted  benzene-­‐ based  tripodal  receptor  10  that  used  three  guanidinium  groups  as  binding  sites   (Figure  6).40  Carboxyfluorescein  was  found  to  bind  with  a  Ka  =  4.7  x  103  M-­‐1  in   aqueous  buffer,  while  citrate  bound  with  Ka  =  2.9  x  105  M-­‐1.  Modulation  of  the  pKa  of   the  phenolic  proton  of  carboxyfluorescein  was  implicated  in  the  decreased   fluorescence  of  free  dye  versus  the  host-­‐dye  complex.     HN H N NH H N NH NHHN HN H N     Figure  6.  Example  of  a  typical  tripodal  dye-­‐discplacement  receptor.     10 10         Alternatively,  replacement  of  a  non-­‐conjugated  spacer  with  a  conjugated   linker  has  proven  an  interesting  approach  to  recent  receptor  design.  It  allows  for   discrete  modulation  of  the  optoelectronic  response  of  a  fluorogenic  receptor  via   conformation  rather  than  just  electronic  effects  from  guest  inclusion,  as  well  as   rigidifying  the  receptor.  This  provides  an  element  of  size-­‐based  recognition  and  can   be  exploited  to  modulate  the  fluorescent  response,  either  through  twisting  of  the  π-­‐ system41-­‐43  or  extension  of  excitation/emission  into  the  near-­‐IR  for  use  in  biological   systems.44  Regardless  of  the  desired  properties,  this  approach  is  closely  related  to   traditional  FSR  receptors,  although  in  this  instance  the  spacer  plays  a  more  active   role  in  enforcing  receptor  conformation.  Integration  of  these  components  can  access   smaller  molecular  sensing  systems  as  well  as  provide  additional  information  about   the  binding  geometry  via  modulation  of  optoelectronic  response.       Modularity  in  Synthesis.  Convergent  syntheses  are  a  common  route  in  molecule   assembly.  The  well-­‐studied  techniques  of  arene-­‐acetylene  cross-­‐coupling  can  allow   the  supramolecular  chemist  to  synthesize  and  derivatize  a  wide  array  of  functional   subunits  with  spacers  that  transduce  signal  themselves,  rather  than  separating  these   into  independent  moieties  in  the  receptor.45  These  can  then  be  easily  linked   together  in  a  convergent  fashion  through  a  multitude  of  cross-­‐coupling  reactions,   most  of  which  are  characterized  by  their  relatively  benign  reaction  conditions.46  This   modular  approach  to  synthesis  allows  for  facile  and  effective  screening  of  candidates   by  allowing  quick  and  subtle  changes  to  each  building  block.  Most  of  the   11     phenylacetylene  work  mentioned  thus  far  has  made  use  of  sequential  cross-­‐ couplings  of  independently  synthesized  subunits,  and  the  budding  field  of  alkyne   metathesis  may  open  up  another  efficient  and  modular  strategy  in  the  synthesis  of   ethynyl  or  butadiynyl-­‐containing  small  molecules.47,48  In  tuning  binding  parameters   such  as  cavity  size,  bite  angle  or  the  number  or  relative  position  of  binding  sites,   secondary  properties  (i.e.,  optoelectronic  response,  photostability  or  solubility)  of   the  receptor  scaffold  can  be  adjusted  as  well,  and  simplicity  when  modulating  all  of   these  parameters  is  key  to  quick  and  efficient  discovery  of    “Goldilocks”  candidates   for  high-­‐performance  receptors.         Switchability  in  Selectivity  or  Sensitivity.  Controlling  the  affinity  of  a  host  for  a   specific  analyte  via  allosteric  modulation  (e.g.,  pH  or  ionic  environment)  is  an   interesting  tool  for  modifying  the  selectivity  of  a  binding  site.49,50  This  allosteric   behavior  is  relatively  rare  in  synthetic  receptors,  but  has  particular  implications  for   designing  biomimetic  receptors  that  will  operate  within  the  diminished  pH  windows   in  biological  systems,  where  either  “turn-­‐on”  or  “turn-­‐off”  binding  may  be  desired  in   response  to  pH  changes  in  cellular  compartments.  Notably,  switchable   conformational  control  has  been  shown  in  rotaxanes51  and  in  “FSR”  type  hydrogen-­‐ bonding  receptors.52,53  As  an  example,  the  switchable  complexation  of  uracil  in  two   amine-­‐triazine-­‐crown  ether  receptors  has  been  recently  reported.52  Protonation  of   the  amine  initiated  an  intramolecular  hydrogen-­‐bonding  interaction  between  the   ammonium  moiety  and  the  crown  ether  that  sterically  blocked  the  binding  site.     12         Switchability  in  a  sensor  can  also  come  from  conformational  change  in  induced-­‐ fit  sensors.  In  these  cases  clever  design  can  limit  the  conformational  degrees  of  freedom   such  that  only  a  single  analyte  gives  the  most  intense  response.  For  example,  this  can  be   accomplished  by  appending  fluorophores  such  that  conformational  change  upon   binding  brings  them  into  proximity  for  excimer  formation  (e.g.,  FRET)54  or  redox  active   groups  can  have  their  environments  changed  in  such  a  way  as  to  give  rise  to  a  known   modulation  in  potential  for  non-­‐optical  sensing.55,56  Phenylacetylenic  systems  can  be   exploited  when  engineering  optically  responsive  receptors  in  much  the  same  way,  as   discussed  below.       N N N NH HN O O Me i-Bu OBu N H N N NH HN O O Me i-Bu O         Figure  7.  Macrocyclic  and  acyclic  receptors  11-­‐13b  illustrate  the  influence  of  small   changes  to  H-­‐bonding  character  on  binding  affinities.           Extended  bis-­‐ethynylpyridine  compounds  11  and  12  were  reported  to  bind   deoxyribosides  in  CDCl3  (Ka  =  690  M-­‐1  for  11  and  Ka  =  19000  M-­‐1  for  12,  Figure  7).57   The  modification  of  the  hydrogen  bond  accepting  pyridine  lone  pair  to  a  hydrogen   bond  donating  pyridinone  was  responsible  for  this  significant  increase  in  affinity.   N N CH3 S N H H 11 12 13a 13b N N H S N H H N N H S N HH H X O O 13     This  switchability,  although  engineered  into  the  receptor  during  the  synthesis,  has   interesting  implications  for  the  design  of  receptors  capable  of  binding  anionic  guests.         As  an  example,  pyridylthiourea  13a  exhibits  switchable  affinities  for  either   acetate  or  halide  anions.58  Protonation  as  a  switch  in  this  case  provides  an  additional   hydrogen  bonding  contact  which  further  stabilizes  the  spherical  halides.  Treating  the   protonated  receptor  with  excess  acetate  led  to  deprotonation  and  binding  of  the   residual  acetate  anion.  Replacing  the  arene  C-­‐H  with  a  methyl  group  yielded  13b,   which  had  no  affinity  for  acetate  or  hydrogen  halides,  thus  highlighting  the  role   arene  C-­‐H  hydrogen  bonding  can  play  in  designing  receptors.     Tuning  Receptors  for  Anionic  Targets       As  anions  have  become  the  focus  of  more  and  more  research  efforts,  the   modification  and  application  of  known  cation  receptor  design  criteria  for  anionic   targets  has  grown  as  well.  For  many  years  the  importance  of  anions  in  the  natural   world  was  overlooked.  Relatively  benign  chloride,  carbonate  and  sulfate,  as  well  as   toxic  arsenate  anions  are  found  naturally  in  water  the  world  over,61  or  in  runoff  and   acid  rain  in  the  case  of  industrial  pollutants.62  Anthropogenic  anions  can  be   expanded  to  include  phosphate  and  nitrates  from  agriculture,63  or  pertechnetate   and  perchlorate  from  industrial  waste  streams.64,65  Their  ubiquity  in  the  natural   world  has  lead  to  an  increase  of  research  in  this  field  with  modest  advances  made  in   the  characterization  and  sequestration  of  electron-­‐rich  wastewater  contaminants.   This  has  led  to  elegant  designer  nanomaterials  that  offer  selectivity  for  some  of   14     these  myriad  problematic  anionic  pollutants  present  in  both  developing  and   developed  countries.66,67b       In  spite  of  their  prevalence,  targeting  anionic  substrates  has  its  own  inherent   challenges.  Their  low  charge  to  radius  ratio,  high  solvation  energies,  polarizability   and  the  large  range  of  preferred  geometries  (or  lack  thereof)  make  them  difficult   targets  in  competitive  media.1-­‐3  Protic  solvents  tend  to  form  extremely  stable   hydrogen  bonds  with  most  anions,  which  mandates  an  extremely  strong  host-­‐guest   interaction  if  any  binding  is  to  be  accomplished.  On  the  other  hand,  relatively   nonpolar  solvents  give  rise  to  ion-­‐pairing,  which  can  have  a  significant  negative   influence  on  binding  ability.  In  addition,  many  biological  anions  exist  only  within   narrow  pH  windows.  Nature  has  many  strategies  to  overcome  these  difficulties,  a   fact  illustrated  beautifully  by  the  complexity  of  many  of  the  natural  receptors  whose   function  depends  upon  their  selectivity  for  specific  anions.  A  particularly  elegant   example  was  the  elucidation  of  the  StCIC  and  EcCIC  chloride  ion  channels  via  X-­‐ray   crystallography  in  2002.68  These  CIC  ion  channels  are  selective  for  Cl-­‐  and  Br-­‐  through   partial  positive  charges  within  the  channels,  rather  than  a  fully  electrostatic   interaction  with  the  nearby  lysine  and  arginine  residues  which  would  bind  too   strongly  and  inhibit  the  function  of  the  channel.  Interestingly,  the  gating  mechanism   necessary  for  the  channel  to  function  is  hypothesized  to  depend  on  two  chloride   binding  events,  and  that  even  small  changes  in  the  anionic  substrate,  i.e.,  from   chloride  to  bromide  anion,  alter  the  operational  efficiency  of  the  channel.69  In  spite   of  insights  such  as  these  into  the  complexity  of  Nature’s  use  of  anion  coordination   15     chemistry  in  cell  regulation,  our  understanding  of  how  the  properties  of  specific   anions  affect  changes  in  these  systems  is  severely  limited.     Common  Functional  Groups  for  Targeting  Anions.  This  dissertation  focuses  on   receptors  with  linked  sp-­‐carbon  atoms  to  which  are  appended  a  variety  of  functional   groups:  arenes  such  as  pyrrole,  indole,  carbazole,  or  carbonyl-­‐containing  amide,   urea,  thiourea  or  sulfonamide  functionalities.78  This  combination  can  translate  into   well-­‐defined  binding  sites,  whether  they  be  based  strictly  on  polycyclic  arenes  or   involve  extension  via  acetylenic  linkers,  as  well  as  impart  distinct  optoelectronic   properties  to  these  receptors.  While  the  inclusion  of  metal  centers  is  an  important   design  motif,59  contributions  from  organometallic  receptors  for  anions  have  been   recently  reviewed60  and  are  beyond  the  scope  of  this  literature  review.         An  early  example  of  an  arene-­‐alkyne  based  receptor  attempted  to  reinforce   face-­‐to-­‐face  interactions  between  the  host  and  guest  via  multiple  butadiyne  linkages   that  were  not  in  conjugation.  Investigation  of  the  binding  affinities  for  heterotricyclic   receptors  14a-­‐d  found  that  these  bound  large,  flat  substrates  well  with  the  highest   binding  constants  observed  for  the  largest  substrates  (e.g.,  terephthalate2-­‐  >  2,6-­‐ naphthalenedicarboxylate2-­‐  >  2,6-­‐anthraquinonedisulfonate2i)  as  these  fit  the  large,   reinforced  binding  pocket  better  (Figure  8).70     16     14a: X = O Y = -(CH2)6- 14b: X = O Y = -(CH2)2O(CH2)2- 14c: X = O Y = -(CH2CH2O)2CH2- 14d: X = NH Y = -(CH2)2O(CH2)2- N Me N Me X X X X S S Y   Figure  8.  Bicyclic  14  illustrating  the  effect  incremental  increases  in  binding  pocket  size   can  have  on  binding  strength.         The  binding  constants  with  neutral  adenosine  were  measured  in  an  aqueous   buffer  (log  Ka  =  4.00,  3.87,  3.86  and  4.00,  14a-­‐d  respectively)  and  followed  the  same   trend  with  doubly  charged  AMP  (log  Ka  =  4.08,  3.79,  3.92  and  4.08).         Alkyne-­‐linked  macrocyclic  indole  and  indolocarbazole  receptors  15  and  16   were  synthesized  and  their  anion  affinities  probed  in  acetonitrile  (Figure  9).71  It  was   found  that  further  rigidification  of  receptor  15  to  16  very  modestly  increased  binding   constants  (e.g.  Cl-­‐    Ka  =  1.5  x  106  M-­‐1  to  2.1  x  106  M-­‐1,  N3-­‐  Ka  =  8.8  x  105  M-­‐1  to  9.1  x   105  M-­‐1,  H2PO4-­‐  Ka  =  2.1  x  106  M-­‐1  to  3.2  x  106  M-­‐1).  A  crystal  structure  of  the  16•Cl-­‐   complex  revealed  that  the  binding  pocket  was  slightly  too  small  to  incorporate  the   Cl-­‐  anion  completely.  Both  of  these  receptors  exhibited  increased  affinities  over   previously  studied  acyclic  receptors  17  and  18.72  Rigidification  in  this  system  had  the   same  effect  as  in  the  macrocyclic  versions  (17:  Ka  =  5100  M-­‐1  to  18:  110,000  M-­‐1  for   Cl-­‐).  In  more  recent  work,  19  was  used  to  study  the  preferred  binding  geometry  of   azide,  halide  and  oxoanionic  guests.73       17     N H N H H N H N tBu tBu tButBu     N H N H H N H N tBu tBu tButBu     N H N H tBu tBu O NH O HN         N H N H tBu tBu O NH O HN     Figure  9.  Binding  studies  performed  with  15-­‐18  are  excellent  examples  of  the   consequences  of  overly  restricting  the  degrees  of  freedom  in  a  receptor.           Changing  the  ethynyl  linker  in  16  to  butadiynyl  in  19  decreased  the  affinity  for   Cl-­‐  anion  over  four  fold,  although  the  affinity  for  Br-­‐  and  I-­‐  anions  was  greater  for  the   larger  cavity  of  19  (Figure  10).  There  was  no  affinity  for  acetate,  but  other  polyoxo-­‐ anions  (H2PO4-­‐,  NO3-­‐  and  HSO4-­‐)  exhibited  increased  affinities  of  one  to  two  orders  of   magnitude.  Azide  bound  in  an  orthogonal  fashion  (normal  to  the  macrocycle  plane)   in  ethynyl  linked  16  with  one  N  atom  in  the  cavity,  but  butadiynyl  19  had  a  large   enough  binding  pocket  to  fully  accommodate  azide  in  a  linear  fashion,  with  a   concomitant  increase  in  binding  constant  (Ka  =  2300  M-­‐1  to  81,000  M-­‐1).  The  binding   events  in  these  receptors  were  followed  by  UV-­‐Vis  or  1H-­‐NMR  spectroscopy;  the   change  in  their  fluorescence  emission  was  not  reported.  The  cleft-­‐like  derivative  20   15 16 17 18 18     was  studied  as  well  and  found  to  strongly  and  selectively  bind  H2PO4-­‐  (Ka  =  1.1  x  105   M-­‐1)  due  to  the  inclusion  of  two  additional  hydrogen  bond  acceptors  in  the  ethynyl   “arms”.74  Although  the  binding  constant  for  this  system  is  smaller  than  for  their   previously  reported  macrocyclic  receptor  16,  the  selectivity  increased,  highlighting   the  well-­‐designed  binding  pocket  for  the  geometry  of  the  desired  guest.  As   expected,  when  binding  guests  with  hydrogen  bond  donating  capability  the  pyridine   nitrogens  were  pointed  into  the  cavity  (e.g.,  20•H2PO4-­‐).  The  pyridine  nitrogens   rotated  out  when  binding  guests  lacking  hydrogen  bond  donating  ability  (e.g.,  20•Cl-­‐ ),  and  this  was  accompanied  by  a  downfield  shift  of  the  C-­‐H  protons  at  the  3  position   in  the  arene  rings  indicating  C-­‐H…anion  hydrogen  bonding.    This  underscores  the   need  for  some  flexibility  in  the  conformation  of  the  binding  site  for  selective   receptors,  as  well  as  an  increased  degree  of  flexibility  in  the  scaffold.     N H N H H N H N tBu tBu tButBu N N tBu tBu N N P O O O OH H H H     N N tBu tBu N N Cl- H H H H       Figure  10.  Macrocycle  19,  an  enlarged  version  of  16  and  cleft  receptor  20  in  both  the  “H-­‐ bond  accepting”  and  “H-­‐bond  donating”  binding  modes.         19 20•H2PO4- 20•Cl - 19         Invariably  receptor  systems  must  contain  some  signalling  unit  to  function  as  a   sensor,  as  showcased  in  the  phenylacetylene-­‐based  tripodal  receptor  for  heparin  in   serum  21  (Figure  11).75  In  21  the  three  ammonium-­‐bearing  arms  were  extended   from  the  fluorophore  body  by  ethynyl  linkages,  which  proved  to  be  the  structural   criterion  necessary  for  effective  binding  of  anionic  heparin.  In  contrast,  22,  with  its   closely  packed  tripodal  arms,  proved  insufficiently  sensitive  to  be  viable  in  biological   media  such  as  serum.76  This  was  attributed  to  non-­‐specific  binding  of  proteins  in   serum  which  displaced  the  dye  bound  in  the  receptor.    Additionally,  this  provided   elegant  precedent  for  the  ability  of  small-­‐molecule  synthetic  receptors  to  be  viable   probes  for  complex  biological  substrates  in  competitive  media.     H N O NH3 N H O B OHHO N NHO H3N HN O B HO OH N HN O NH3O NH B OH OH N NH O H3N HN O B OH HO N HN O NH3 NHO B OH OH N H N ONH3 O N H B OHHO N   Figure  11.  Tripodal  alkyne  containing  receptor  21  was  effective  in  biological  media  and   improved  over  the  smaller  cavity  of  22  while  retaining  its  desired  secondary  properties   (e.g.,  solubility).     21 22 20     23a: n = 0 23b: n = 1 24     Recent  work  has  made  use  of  fluorescent  “turn-­‐off”  anion  sensing  modes77  and   phenylacetylene  subunits  for  both  “turn-­‐on”  signalling  and  binding  site  size   enforcement.78  The  chloride  binding  properties  of  diphenylacetylene-­‐based  anion   receptors  23a,b  exhibited  “turn-­‐off”  fluorescence  in  the  presence  of  a  suitable  guest   (Figure  12).  Bisurea  23a  exhibited  quenched  fluorescence  emission  in  its  unbound   “open”  state.  The  DFT  minimized  conformation  had  the  typical  low  fluorescence   observed  in  diphenylacetylenes  due  to  the  dark  πy*←  πx  (1A1u)  transition  being  close  in   energy  to  the  emissive  πx*←  πx  (1B1u)  transition.  Fitting  a  suitably  sized  guest  in  the   receptor  cleft  (in  this  case  Cl-­‐  anion)  induced  planarity  by  rotation  around  the  alkynyl   bond.  This  increased  the  energy  of  the  1A1u  transition,  and  the  bound  receptor  thus   became  emissive.  Binding  constants  for  model  systems  23b  and  24  were  also  measured   against  halide  and  oxoanions.  Receptor  23a  had  the  highest  affinity  for  Cl-­‐  (log  ß  =  2.557   versus  1.831  for  23b    and  <1  for  24).  The  length  of  the  phenylacetylenic  linker  influenced   size  selectivity,  as  Br-­‐  was  bound  by  23a  and  not  by  23b.  None  of  the  receptors  exhibited   any  affinity  for  NO3-­‐.     NH HN NH O HN O n         NH NH O   Figure  12.  Fluorescent  “turn-­‐on”  sensors  for  Cl-­‐  (23a,b)  and  the  model  compound  used   to  determine  the  conformational  dependence  of  the  fluorescence  emission  (24).     21     25     The  allosteric  binding  of  25,  a  macrocyclic  receptor  with  a  central   tetrafluorophenyl  “turnstile”  suspended  in  the  cavity  by  ethynyl  bridges,  was  studied  by   NMR  spectroscopy  (Figure  13).79  The  turnstile  inhibited    both  amide  binding  sites  in  the   free  receptor.  Upon  binding  one  equivalent  of  a  guest  the  tetrafluorophenyl  gate  was   opened  and  allowed  access  to  the  second  binding  site.  Acetate,  Br-­‐,  and  phosphate   bound  cooperatively  (Hill  coefficients  of  1.4,  1.5  and  1.4,  respectively).  Interestingly,  Br-­‐   anion  was  large  enough  (1.82Å  in  an  octahedral  environment)  to  exhibit  cooperative   binding,  but  Cl-­‐  (1.67Å)  ostensibly  did  not,  although  chloride  had  the  higher  Ka1  with   approximately  equivalent  second  binding  constants.  This  was  reflected  in  the  Hill   coefficient  for  Cl-­‐  anion  of  1.1.   F F F F O O N H H N N H H N O O F F F F OO O O F F F F tBu tBu     Figure  13.  Allosteric  receptor  25  exhibited  no  cooperativity  with  smaller  guests,  i.e.,  Cl-­‐,   but  cooperative  binding  for  Br-­‐  and  larger  oxoanions.       22     26 27a: n = 7 27a: n = 7 27b: n = 110 N N NHHN                                           N N NHHN OC12H25 C12H25O n       Figure  14.  Monomeric  26  and  polymeric  27  both  bound  guests  in  the  typical  Hofmeister   fashion,  but  polymerization  increased  binding  34-­‐fold.         Based  on  earlier  work,80  dipyrrolylquinoxaline  derivative  26  was  reported  to   bind  anions  with  both  a  chromogenic  and  fluorogenic  response  (Figure  14).81  This   monomer  exhibited  affinity  for  anions  (F-­‐  >  HP2O7-­‐3  >  CN-­‐  >  OAc-­‐  >  H2PO4-­‐  ≈  Cl-­‐  ≈  Br-­‐  ≈   I-­‐  ≈  NO-­‐3)  correlating  to  the  relative  basicity  of  the  guest,  although  fluoride  and   pyrophosphate  were  found  to  deprotonate  the  receptor.  Polymerization  to  27a  and   27b  was  accompanied  by  a  34-­‐fold  increase  in  optoelectronic  response,  which   translates  into  increased  sensitivity  with  increased  repeat  units.         Lastly  it  is  worth  noting  the  two-­‐photon  absorption  (TPA)  properties  that  the   increased  conjugation  length  of  some  phenylacetylenes  can  lend  to  a  probe.  Cross-­‐ conjugated  D-­‐π-­‐A-­‐π-­‐D  bis(anilinoethynyl)-­‐functionalized  pyridine  28  was  synthesized   and  its  properties  as  a  two-­‐photon  induced  polymerization  (TPIP)  initiator  were   studied  (Figure  15).82  While  free-­‐base  28a  was  too  poor  an  acceptor  to  provide  a   good  TPA  cross  section,  cationic  28b  was  assumed  to  have  a  much  higher  value,   though  this  ultimately  could  not  be  verified  due  to  the  poor  solubility  of  28b.       23     28a: X = N 28b: X = NMe+ X Me2N NMe2   Figure  15.  Two-­‐photon  absorbing  phenylacetylene  28.           It  has  also  been  reported  that  TPA  fluorophores  of  the  A-­‐π-­‐A  type  can  be   modulated  via  their  planarity,  which  has  also  been  a  demonstrated  handle  for   supramolecular  sensors.83  A  combination  of  selective  targeting  and  low  energy   excitation  and  emission  is  a  promising  application  for  soluble  phenylacetylene-­‐based   sensors  in  biological  media.     Biological  Applications  for  Phenylacetylene-­‐based  Sensors       There  are  several  biochemical  factors  to  consider  in  the  design  of  new   intracellular  ion  indicators.    These  include  the  loading  of  the  indicator(s)  into  target   cells,84-­‐88  maximizing  optimal  detection  parameters89  with  minimal  toxicity90  and  the   ability  to  selectively  quantitate  the  ion  concentration  in  question  within  the  cells  or   tissues  being  examined.91  Within  these  areas  are  several  additional  factors  that   affect  utility  including  compartmentalization  or  partitioning  within  the  cell  into   specific  organelles,92  matching  optical  excitation/emission  wavelengths  to  match   common  instrumentation  in  use93  and  the  use  of  ratiometric  determination  methods   to  help  quantitate  binding  and  ion  levels.94,95  Finally,  factors  such  as  specificity   versus  other  intracellular  ions,96  water  solubility,97  relative  binding  constants  for  the   24     intracellular  ion  or  ions98  and  the  effect  of  pH  on  binding89,99  and  fluorescence   emission91  are  also  important  factors  to  be  optimized  for  biochemical  probe   optimization.  Of  course,  it  is  impossible  to  optimize  all  parameters,  but  of  ultimate   importance  are  ion  selectivity  and  the  ability  to  quantitate  intracellular   concentration.         Anions  in  cells  are  present  at  roughly  70%  of  all  enzymatic  sites  and  are   responsible  for  everything  from  the  activation  of  signal  transduction  pathways  to   maintaining  osmotic  pressure  and  cell  volume.1,100  They  are  involved  in  many  disease   pathways,  from  cystic  fibrosis  to  osteoporosis.101-­‐103  In  mitochondria,  at  least  14   different  anion  transport  pathways  have  been  identified104  and  are  responsible  for   the  regulation  and  trafficking  of  ADP,  ATP,  citrate,  maleate  and  halide  anions,  among   others.105,106  The  ubiquity  of  these  molecules  in  living  organisms,  and  their   importance  in  regulating  life  systems  can  best  be  summed  up  in  the  realization  of   the  polyanionic  character  of    both  DNA  and  RNA.  The  acidity  of  intracellular   compartments  has  been  implicated  in  some  disease  pathways,  notably  in  the  cellular   breach  of  anthrax  lethal  toxin  and  edema  toxin.107  This  breach  has  been  correlated   with  decreased  endosomal  pH,  which  can  be  achieved  either  by  concomittant   movement  of  K+,  or  an  influx  of  Cl-­‐.       One  recently  reported  example  of  a  ratioable  fluorescent  Cl-­‐  probe  was   dextran-­‐tethered  acridinium  system  33,  used  for  charting  endosomal  Cl-­‐   concentration  in  tandem  with  endosomal  pH  (Figure  16).99  The  biaccridinium  subunit   of  the  receptor  was  found  to  be  quenched  by  Cl-­‐  anion  with  a    Stern-­‐Volmer  constant   25     33 of  36  M-­‐1,  and  to  be  insensitive  to  non-­‐halide  anions  (nitrate,  phosphate,   bicarbonate  and  sulfate).  By  tethering  this  system  to  tetramethylrhodamine,  which  is   insensitive  to  Cl-­‐,    they  developed  a  ratioable  sensor  for  in  vivo  application  that   allowed  them  to  observe  the  change  in  Cl-­‐  concentration  in  endosomes  with   decreasing  pH.    Using  this  same  technique,    it  was  also  shown  that  the  intracellular   CIC-­‐3  Cl-­‐  channel  regulated  the  vacuolar  H+  pump  during  endosomal  acidification.108   The  ease  with  which  a  well  designed  small  molecule  sensor  can  visualize  these   complex  biological  responses  demonstrates  the  import  role  these  receptors  will    play   in  furthering  our  understanding  of  cellular  processes.     NN O HO H N O dextran-TMR     Figure  16.  The  structure  of  the  Cl-­‐  sensitive  moiety  of  the  in  vitro  functional  fluorogenic   probe  33.             A  series  of  linked  pyridylarenes  34  were  used  as  selective  antagonists  for  the   metabotropic  glutamate  receptor  subtype  5  (mGlu5)(Figure  17).109  It  was  found  that   phenylethynyl  derivative  34c  (MPEP)  was  the  most  active  antagonist,  and  bound  the   receptor  much  more  effectively  than  the  non-­‐ethynylated  receptors.  This  work  was   continued  with  radiolabelled  derivatives  35a110  and  35b-­‐d.111  These  radiolabelled   compounds  were  thought  to  be  appropriate  for  binding  and  following  the   26     distribution  of  mGluR5  receptors.  Radiolabelled  35a  possessed  a  high  affinity  (Kd  =  2   nM)  and  was  over  90%  specific  for  mGlu5  receptor  over  the  1-­‐10  nM  range.       N N N OH     N     N   N O T T T     NH311C   N O 11CH3     N N O 11CH3     Figure  17.  First  generation  inhibitors  34a,b  were  improved  by  including  the  ethynyl   bridge  in  34c.  This  receptor  was  radiolabelled  systematically  (35).     35b ([11C]MPEP) 34a 34b 34c 35a 35c ([11C]M-MPEP) 35d ([11C]M-PEPy) 27       Figure  18.  Coronal,  axial  and  sagittal  PET  images  of  derivatives  of  35  in  anesthetized  rat   brain  at  8-­‐10  min  after  administration  of  radiolabelled  ligand.  The  coronal  level  15.2   corresponds  to  the  olfactory  area;  11.2  the  cingulate  level;  10.0  the  striatal  level;  4.2  the   hippocampal  level;  and  -­‐2.8  the  cerebellar  level.  The  axial  and  sagittal  views  illustrate   the  distribution  of  the  radioactivity  at  the  mid-­‐striatal  level. (Reprinted  from  ref.  111   with  permission  from  Elsevier).         Expanding  upon  35a,  ligands  35b-­‐d  were  also  utilized  as  PET  imaging  agents  in     Sprague-­‐Dawley  rats.111  Bioaccumulation  of  the  radiolabelled  agents  were  tracked     by  in  vivo  microPET  imaging  (Figure  18),  and  found  to  have  the  highest  binding  in  the   olfactory  bulb,  followed  by  striatum,  hippocampus  and  cortex  localization.  It  was   hypothesized  that  the  glutamate  receptor  mGluR5  might  have  major  physiological   function  in  the  oflactory  area  as  olfactory  damage  in  neurodegenerative  diseases  is   consistent  and  severe.112  This  would  also  suggest  that  early  diagnosis  of  Parkinson’s   or  Alzheimer’s  could  be  achieved  via  the  olfactory  bulb.   28             Related  work  with  ß-­‐amyloid  plaques  (Aß  plaques)  as  pathological  features  of   Alzheimer’s  onset  made  use  of  indolinyl-­‐  and  indolylphenylacetylenes  as  PET  imaging   agents.113  Both  36a  and  36b  were  found  to  bind    Aß  plaques,  with  36b  being  slightly   more  selective  in  early  trials  (via  autoradiography,  Figure  19).  No  binding  constants   were  reported,  although  relative  binding  was  inferred  from  washout  rates.       (OCH2CH2)318FHN     (OCH2CH2)318FHN     Figure  19.  PET-­‐imaging  agents  designed  to  bind  Aß  plaques         Phenylethynylamides  37a,b  were  found  to  be  potent  G-­‐quadruplex  binders   (Figure  20).114  Binding  was  studied  in  this  system  by  FRET  melting  assays,  surface   plasmon  resonance  and  CD  spectroscopy.  Moderate  stabilization  with  G-­‐ quadruplexes  were  observed  for  both  ligands.  No  discernible  duplex  DNA   stabilization  was  reported.  As  there  is  evidence  that  small  molecules  can  bind  G-­‐ quadruplexes  and  modulate  transcription,  selectivity  like  this  is  promising  for  future   application  of  these  acyclic  compounds  in  this  area.  Additionally,  the  1H-­‐NMR   experiments  reported  were  carried  out  in  aqueous  buffer,  notable  due  to  the  low   solubility  for  related  analogues  (no  amide  functionality)  and  water-­‐solubility  for   many  arylethynyl  probes  is  a  barrier  to  their  use  as  bioimaging  agents.     36a 36b 29         X NH2 H2N O NHR O RHN   Figure  20.  G-­‐quadruplex  DNA  binding  anilinoethynylpyridine  37  made  water-­‐soluble   by  inclusion  of  the  dimethylaminopropyl-­‐appended  amides.       Conclusions       This  introductory  chapter  introduces  phenylacetylenes  as  important   components  in  the  design  of  an  increasingly  diverse  array  of  supramolecular  host-­‐ guest  complexes.  Their  unique  combination  of  optoelectronic  properties,   contribution  to  conjugation  and  shape  persistence  has  played  an  important  role  in   the  development  of  many  novel  coordination  compounds,  fluorogenic  and   chromogenic  probes  and  biological  imaging  agents.  In  spite  of  this,  non-­‐metal-­‐ containing  host-­‐guest  complexes  that  make  use  of  only  simple  organic   phenylacetylenes  have  only  recently  received  attention.  Their  contribution  to  the   rational  and  effective  design  of  receptors  able  to  target  both  neutral  and  ionic  guests   with  concomitant  optoelectronic  response  upon  binding  is  at  the  core  of  this   advancement.         Additionally,  commonly  used  synthetic  techniques  allow  for  facile  and   efficient  preparation  of  a  variety  of  novel  candidates  for  study,  which  further  drives   innovation  in  this  field,  suggesting  potential  applications  in  molecular  probe       R = (CH2)3N(CH3)2 37a X = CH 37b X = N 30     development,  nanotechnology,  and  even  recognition  of  biologically-­‐relevant   molecules  and  ions.      Bridge  to  Chapter  II       Chapter  I  served  as  an  illustration  of  the  steric  and  electronic  benefits  alkyne   linkers  can  bring  to  a  fluorophore,  even  for  use  in  atypical  environments,  such  as   aqueous  media  or  in  vitro/in  vivo  application.  The  second  chapter  will  introduce  the  first   scaffold  we  chose  to  build  our  probes  upon.  Additionally,  the  simplest  amide  derivatives   of  this  scaffold  and  their  basic  optoelectronic  properties  are  presented,  as  well  as   solution  and  solid-­‐state  assays  used  to  expose  their  metal  cation  binding  ability.  These   experiments  serve  as  proof  of  principle  of  our  design  strategy,  while  allowing  us  the   luxury  of  using  well-­‐known  titration  experiments  to  target  simple  cations  as  the   experimental  basis  for  our  ultimate  venture  into  building  an  effective  receptor  for   anions.     31       CHAPTER  II     SYNTHESIS  OF  FIRST  GENERATION  RECEPTORS  AND  PROOF  OF  PRINCIPLE     Introduction   This  chapter  was  coauthored  with  Dr.  Orion  Berryman  and  Dr.  Charles  Johnson,   both  of  whom  provided  crystallographic  support  and  editorial  assistance,  and  Daisuke   Inokuchi  who  performed  the  synthesis  of  11  and  12.  My  advisors  Michael  M.  Haley  and   Darren  W.  Johnson  conceptualized  the  project  and  provided  editorial  assistance  while   Dr.  Lev  N.  Zakharov  solved  the  diffraction  data  for  the  crystal  structures  presented   herein.         Previous  investigation  in  the  Haley  lab  of  novel  planar  molecular  topologies  for   organic  optoelectronics  led  to  the  pyridine-­‐containing  organic  and  inorganic   heterocycles  1  and  2  (Figure  1).1       N t-Bu t-Bu       N t-Bu t-BuPt PEt3 Et3P       Figure  1.  Macrocycle  1  and  platinacycle  2.       1 2 32         Both  compound  1  and  2  had  well  characterized  optoelectronic  properties  that   seemed  to  bode  well  for  their  use  as  scaffolds  upon  which  to  build  a  non-­‐covalent   receptor.1  However,  the  fully  organic  macrocycle  1  has  only  two  coordination  sites  (the   diyne  bridge  and  pyridine  lone  pair)  while  inclusion  of  the  covalently  bound  Pt  moiety  in   2  sterically  crowded  the  cavity.         A  key  aspect  of  chemosensor  design  as  opposed  to  chemodosimeter  design  is   reversibility,  and  as  such  the  scaffold  needed  functional  handles  upon  which  to  append   hydrogen-­‐bonding  groups.  The  possibility  of  using  the  pyridine  nitrogen  as  a  switchable   hydrogen  bond  acceptor/donor  upon  protonation  led  us  to  consider  a  three-­‐coordinate   design  that  could  be  achieved  by  changing  the  covalent  ethynyl  linkages  to  Pt  in  2  to   easily  functionalizable  anilines  or  phenols,  depending  upon  the  desired  target  (Figure  2).     N t-Bu t-Bu XX N Ht-Bu t-Bu XX X = NH2 or OH   Figure  2.  Ethynylarene  scaffolds  for  three-­‐coordinate  receptors.         While  phenolic  substituents  would  garner  us  a  receptor  suitable  for  cationic   species  (by  lone  pair  donation)  our  interest  lay  in  receptors  for  anions,  and  thus  we   designed  a  simple  retrosynthesis  of  dianiline  3  from  previously  published  or   commercially  available  starting  materials  (Scheme  1).2     33     N R R H2NNH2 R NH2 TMS NBr Br + R NH2 R = Alkyl, OR', CO2R', etc.     Scheme  1.  Retrosynthesis  of  parent  scaffold.     Starting  from  simple  aniline  building  blocks  allows  for  facile  modification  of   portions  of  the  receptor,  thus  affording  us  an  efficient  route  to  systematic  adjustment  of   receptor  properties.  By  mixing  and  matching  these  modular  synthons,  large  libraries  of   receptors  can  be  quickly  synthesized  and  screened  for  desired  behavior  (e.g.,  binding   strength,  fluorescence  emission  output  or  solubility).  These  parent  scaffolds  can   subsequently  be  functionalized  with  a  variety  of  hydrogen  bond  donating  or  accepting   groups  depending  on  the  desired  optoelectronic  output,  binding  target  or  application   (e.g.,  fluorometric  or  electrochemical  sensing).     The  Parent  Dianiline  Scaffold   Arylethynylpyridine  3  was  the  first  scaffold  synthesized  (Scheme  2).2  The  tertiary   butyl  group  was  chosen  due  to  its  availability,  the  work  done  with  it  previously  and  the   steric  bulk,  which  was  expected  to  decrease  the  self-­‐association  of  the  receptors  in   solution.     34     N t-Bu t-Bu H2NNH2 t-Bu NH2 TMS t-Bu NH2 I TMSA, Pd(PPh3)2Cl2, CuI i-Pr2NH/THF 1. K2CO3, MeOH/CH2Cl2 2. 2,6-dibromopyridine Pd(PPh3)4, CuI, i-Pr2NH/THF 3 70%-85% over 3 steps 1 2   Scheme  2.  Synthesis  of  dianiline  3.           Readily  available  1  was  prepared  by  literature  methodology  from  para-­‐t-­‐butyl-­‐ aniline  by  iodination  with  benzyltriethylammonium  dichloroiodate.3  This  compound   underwent  Sonogashira  cross-­‐coupling  with  trimethylsilylacetylene  which  was   subsequently  deprotected  with  potassium  carbonate  and  two-­‐fold  crosscoupled  to  2,6-­‐ dibromopyridine.4,5       The  absorbance  properties  of  3  and  its  salts  with  trifloroacetic  acid  (TFA)  and  HCl  in   chloroform  are  summarized  below  (Figure  3).         Figure  3.  UV-­‐Vis  absorbance  spectra  of  3,  3•TFA,  and  3•HCl  in  chloroform.   35         Neutral  3  shows  no  absorbance  in  the  visible  region  of  the  spectrum,  and  its  π– π*  absorbance  band  overlaps  the  n–π*  band  at  355  nm.  Upon  exposure  to  TFA  the  n–π*   band  is  hypsochromically  shifted  10  nm,  while  the  π–π*  band  has  an  almost  negligible   hypsochromic  shift  of  3  nm.  The  appearance  of  a  charge  transfer  band  at  465  nm  gives   the  solution  a  yellow  tinge.6  Due  to  the  presence  of  protonizable  anilines  in  3,  the   stronger  acid  HCl  protonates  the  anilines  as  well,  and  the  charge  transfer  character  is  no   longer  observable,  while  both  the  π–π*  and  n–π*  bands  are  bathochromically  shifted   and  can  no  longer  be  distinguished  between.       Figure  4.  Fluorescence  excitation  and  emission  spectra  for  3  and  its  TFA  and  HCl  salts  in   chloroform.  Excitation  was  at  the  excitation  spectrum  λmax  (363  nm,  363  nm  and  375   nm,  respectively).           The  fluorescence  emission  spectra  of  3  and  its  salts  differed  slightly  in   photoluminescent  quantum  yield  (PLQY)  and  in  emission  λmax  values  in  organic  solvents.   36     The  neutral  receptor  had  a  PLQY  of  2.3%,  while  protonation  with  TFA  or  HCl  yielded  a   salt  that  had  a  slightly  diminished  PLQY  (1.8%  and  1.6%,  respectively).  The  emission  λmax   in  3·∙TFA  was  unchanged  from  the  neutral  receptor;  however,  3·∙HCl  was   hypsochromically  shifted  12  nm.  The  excitation  spectra  were  consistent,  indicating  no   change  in  excited  state  conformation  between  3  and  3·∙TFA,  but  a  slight  bathochromic   shift  in  the  maximum  of  excitation  in  3·∙HCl,  indicating  a  diminished  HOMO-­‐LUMO  gap  in   this  species.  The  differences  in  the  protonation  with  TFA  vs.  HCl  could  be  attributed  to   the  protonation  of  the  anilines  with  the  stronger  acid,  and  were  expected  to  be   unobservable  upon  further  functionalization  at  this  position.  The  slight  differences   observed  in  emission  intensity  between  the  neutral  and  protonated  receptors  augered   well  for  the  application  of  this  compound  as  a  switchable  fluorionophore  and  thus  it  was   chosen  as  the  first  candidate  for  further  derivatization.       Functionalized  Phenylethynylpyridines:  Synthesis  and  Metal  Binding  Properties       While  the  scope  of  functional  groups  that  could  be  appended  to  the  dianiline   core  is  broad,  initial  attempts  focused  on  aniline  derivatization  due  to  the   preponderance  of  synthetic  routes  and  literature  procedures.7-­‐9  Amino-­‐  or  anilino-­‐   protecting  groups  as  well  as  simple  substituted  acyl  halides  are  available  commercially   and  abundant.  Additionally,  peptide  coupling  reagents  could  be  used  to  modify  the   aniline  moieties  with  simple  carboxylic  or  benzoic  acid  derivatives  and  are  attractive  due   to  the  ease  of  isolation  of  products  and  functional  group  tolerance.10  Metal  ions  were   chosen  as  the  initial  targets  for  proof  of  principle  studies  due  in  part  to  the  expertise  in   37     the  Johnson  lab  with  metal  cation  binding,  as  well  as  the  stoichiometric  predictability   and  strength  of  binding  in  metal-­‐mediated  self-­‐assemblies.       Amides:  α-­‐Mercaptoamide.  The  first  amide  target  to  be  synthesized  was  α-­‐ mercaptoamide  7  (Scheme  3).11,12  The  pendant  thiols  were  chosen  due  to  the  Johnson   lab’s  expertise  with  mercury  and  arsenic-­‐binding  thiol  macrocycles.13,14  It  was  expected   that  this  binding  motif  would  serve  as  a  good  proof  of  principle  for  observation  of  any   optoelectronic  perturbation  of  the  amide-­‐functionalized  core  upon  binding  ions  in   solution  via  UV-­‐Vis  absorbance  or  fluorescence  emission  measurements.  Additionally,   we  considered  the  possibility  of  using  the  thiol-­‐disulfide  exchange  in  this  receptor  as  an   electrochemical  handle  for  the  development  of  a  single  component,  small  molecule   organic  redox  sensor.       Scheme  3.  Synthesis  of  7  and  first  attempted  synthesis  of  6.     38         Synthesis  began  with  dianiline  3  being  treated  with  chloroacetyl  chloride  and   triethylamine  as  a  solution  in  dichloromethane  to  yield  α-­‐chloroamide  4,  which   underwent  conversion  to  the  acetyl-­‐protected  α-­‐mercaptoamide  5  upon  treatment  with   potassium  thioacetate  in  dimethylformamide  in  good  yield.15  Attempts  to  deprotect  the   thiol  with  potassium  carbonate  invariably  led  to  mixtures  of  the  ring-­‐closed  disulfide  7   and  the  free  thiol,  which  proved  difficult  to  separate  without  oxidizing  the  thiol  to   disulfide  in  the  process.         The  difficulty  in  isolating  appreciable  amounts  of  the  free  thiol  through  simple   deprotection  led  to  multiple  attempts  to  reduce  the  disulfide  or  to  circumvent  the   deprotection  step.  Treatment  of  7  with  dithiothreitol,16  Mg0  in  methanol,17  sodium   borohydride  (NaBH4),  and  lithium  tert-­‐butoxyaluminohydride  (LTBA)  all  failed  to   produce  the  desired  dithiol  compound.  Additionally,  direct  synthesis  of  the  free  thiol   from  thioglycolic  acid  mediated  by  common  peptide  coupling  reagents  (DCC,  EDC,  and   BOP·∙PF6)10  resulted  in  intractable  mixtures.         Treatment  of  4  with  sodium  thiosulfate  (Na2S2O3)  led  to  the  Bunte  salt  8  in   almost  quantitative  yield  (Scheme  4).         Scheme  4.  Synthesis  of  thioketal  9.   39       It  was  expected  that  careful  treatment  of  8  with  aqueous  acid  would  yield  the   free  dithiol  6.18,19  However,  8  suffered  from  extremely  poor  solubility  in  most   water/organic  mixtures.  Treatment  of  these  suspensions  with  acid  resulted  in  recovery   of  starting  material  or  degradation,  most  likely  through  intermolecular  displacement  of   the  α-­‐substituted  sulfur-­‐sulfur  bond  due  to  the  high  local  concentration  of  the   compound  in  poor  solvents,  resulting  in  polymeric  material.  Curiously,  this  compound   was  fairly  soluble  in  acetone,  but  careful  inspection  of  the  subsequent  1H-­‐NMR  spectra   indicated  that  the  dimethyl  thioketal  9  was  being  formed  by  addition  of  the  compound   to  this  solvent.   Careful  consideration  of  X-­‐ray  crystallographic  data  obtained  for  6  and  7  pointed   to  the  possibility  of  using  the  α-­‐substitution  of  these  receptors  as  a  point  upon  which  to   build  steric  bulk  around  the  disulfide  bond  (Appendix  A).20  The  first  and  simplest   derivative  with  which  this  hypothesis  was  tested  is  illustrated  below  (Scheme  5).         Scheme  5.  Synthesis  of  11  and  12.   40           Parent  dianiline  3  was  treated  with  bromoisobutyryl  bromide  and  TEA  in   dichloromethane  to  yield  the  α-­‐bromodimethyl  amide  in  excellent  yield.  This  was   treated  with  potassium  thioacetate  to  efficiently  yield  10.  The  deprotection  of  10  was   achieved  smoothly  under  bubbling  N2  in  methanol  followed  by  slight  basification  before   stopping  the  reaction.  Dithiol  11  was  isolated  in  moderate  yields  and  proved  to  be   stable  to  silica  in  solution  and  to  air  when  in  the  solid  state.  Additionally,  a  small  percent   of  the  disulfide  12  was  isolated  from  the  reaction,  and  11  could  be  treated  with  iodine   to  convert  the  dithiol  quantitatively  to  12,  with  matching  1H-­‐NMR  spectra.  Attempts  to   recover  the  thiol  from  the  disulfide  formed  by  iodine  oxidation  were  unsuccessful,   hinting  at  unusual  stability  of  the  disulfide  bond  in  this  sterically  hindered  analog,  too.       X-­‐ray  quality  single  crystals  of  the  dimethyl-­‐substituted  dithiol  11  were  obtained   from  slow  evaporation  of  methanol  (Figure  5).         Figure  5.  ORTEP  representation  of  11  with  thermal  ellipsoids  drawn  at  the  50%   probability  level.  The  receptor  scaffold  is  coplanar,  deviating  by  ±1.3o  out  of  the  arene-­‐ pyridine-­‐arene  plane.     41           In  contrast  to  the  x-­‐ray  crystal  structure  of  the  unsubstituted  disulfide  7  obtained   under  the  same  crystal  growing  conditions,  the  “arms”  of  the  receptor  in  all  of  the   isolated  single  crystals  of  11  wrap  back  into  a  “W”  conformation.   This  raised  questions   about  whether  guest  inclusion  could  compete  with  intramolecular  disulfide  formation,   since  both  in  the  solid-­‐state  and  in  solution  this  receptor  class  had  been  qualitatively   observed  to  form  extremely  stable  S-­‐S  bonds.  In  addition  to  losing  the  H-­‐bonding   capability  of  the  thiol,  the  disulfide  S-­‐S  bond  bisected  the  plane  of  the  ethynylpyridine   scaffold,  effectively  blocking  the  cleft  of  the  receptor.       After  successfully  isolating  large  quantities  of  11,  we  undertook  to  use  these   optimized  conditions  for  the  isolation  of  larger  amounts  of  6.  The  key  to  the   deprotection  and  work  up  of  that  compound  turned  out  to  be  as  simple  as  a  constant   stream  of  bubbling  N2  through  the  basic  deprotection  solution,  followed  by  careful   acidification  while  continuing  the  N2  bubbling.  This  slight  change  in  the  procedure   allowed  for  the  isolation  of  almost  quantitative  yields  of  6  from  5  on  400-­‐500  mg  scale.   With  the  larger  amounts  now  available,  analytically  pure  6  was  prepared  and  compared   to  7  by  fluorescence  emission,  and  found  to  follow  the  same  trend  as  11  and  12:  the   free  thiol  exhibited  enhanced  fluorescence  over  the  disulfide.  Solutions  of  6  were  also   found  to  be  relatively  stable  to  oxidation  by  air  during  preparation  of  the  fluorescence   samples,  although  they  appeared  to  decompose  when  left  overnight  in  the  cuvet.     However,  11  appeared  to  be  more  stable  than  6,  thus  6  was  not  chosen  as  the  receptor   to  use  in  screening  assays  for  ion  binding.   42     Ion  binding.  In  order  to  probe  the  feasibility  of  our  cleft  design,  as  well  as  offer   evidence  of  the  metal  ion  binding  ability  of  this  receptor,  many  attempts  were  made  to   co-­‐crystallize  both  11  and  12  with  metal  cations.  Known  thiophilic  metals  (e.g.,  Hg,  Sn   and  As)  were  subjected  to  a  variety  of  crystallization  conditions  with  11,  of  which  a   mixture  of  the  receptor,  Hg(OAc)2  and  TEA  in  MeOH  provided  large,  red  single  crystals   suitable  for  x-­‐ray  analysis.       Figure  6.  ORTEP  representations  of  11·∙Hg(II)  with  thermal  ellipsoids  drawn  at  the  50%   probability  level.  N—Hg  bond  distance:  2.743  Å;  S-­‐Hg  distance:  2.336,  2.341  Å;  S-­‐Hg-­‐S   bonds  deviate  from  linearity  by  8.43o.       From  the  planarity  in  the  free  thiol  along  with  the  induced  torsion  in  the  Hg-­‐ containing  and  disulfide-­‐linked  structures,  it  could  be  inferred  that  the  fluorescence   emission  spectra  of  these  species  should  be  significantly  different.     43       Figure  7.  Excitation  and  emission  spectra  of  11,  11·∙Hg(II)  and  12  (excitation  at  335  nm)   in  chloroform.           The  excitation  spectra  of  11  and  12  are  similar  in  the  250-­‐335  nm  region,  and   both  match  their  UV-­‐Vis  spectra  perfectly,  indicating  no  change  in  excited  state   geometry  in  solution  (Figure  7).  Intriguingly,  the  π-­‐π*  region  of  the  excitation  spectrum   (335-­‐360  nm)  is  significantly  different,  with  both  a  slight  hypsochromic  shift  in  the  λmax   and  a  decrease  in  intensity  for  the  disulfide  12.  This  results  in  quenched  emission  when   exciting  at  335  nm,  and  the  receptor  exhibits  an  “ON-­‐OFF”  response  upon  oxidation  to   the  disulfide.  Inclusion  of  the  metal  ion,  however,  recovers  the  fluorescence  emission   but  bathochromically  shifts  the  emission  maximum  26  nm.    This  is  unusual  in  heavy   metal  ion  fluorionophores,  which  normally  experience  heavy-­‐atom  quenching  in  the   presence  of  these  species  due  to  a  lowering  of  the  energy  barrier  to  intersystem   crossing  and  non-­‐radiative  decay  of  the  fluorescence.21,22  This  phenomenon  is  currently   being  more  fully  explored  in  the  lab,  as  these  results  are  extremely  promising  in  both   44     the  development  of  an  “OFF-­‐ON”  fluorescent  indicator  for  heavy  metals  and  a  redox   sensitive  small  molecule  fluorogenic  probe.     Amides:  Salicylamide.  The  synthetic  pathways  to  the  salicylamide  receptor  are  shown   below  (Scheme  6).       Scheme  6.  Reagents  and  conditions:  (a)  salicylic  acid,  DCC,  HOSu,  DMAP,  DIEA,  DCM,  (b)   salicylic  acid,  BOP•PF6,  TEA,  DCM           Synthesis  of  the  salicylamide  was  accomplished  through  well  known  peptide   coupling  conditions  in  both  cases.10  In  spite  of  the  lowered  yields,  this  methodology   avoids  the  need  for  protection  and  subsequent  deprotection  of  the  ortho-­‐hydroxyl   group  that  would  be  necessary  if  synthesis  proceeded  through  the  more  mundane  acyl   chloride  or  mixed  anhydride  methods.  The  impetus  for  the  synthesis  of  13  was  to  create   a  switchable  metal  cation/inorganic  anion  sensor  based  upon  the  protonation  state  of   the  pyridyl  nitrogen  and  the  salicylate  hydroxyl  groups.       45       Figure  8.  UV-­‐Vis  data  for  13  and  13·∙TFA  in  acetonitrile.         The  neutral  and  protonated  state  absorption  data  for  13  correlate  well  with  the   parent  dianiline  3.  The  neutral  compound  exhibited  hypsochromically  shifted  π-­‐π*  and   n-­‐π*  absorbance  bands  by  almost  30  nm  as  compared  to  3.  Upon  exposure  to  acid  a   charge  transfer  band  was  apparent  in  the  400  –  450  nm  range,  accompanied  by  a   hypsochromic  shift  in  the  rest  of  the  spectrum.  This  charge  transfer  band  did  not   disappear  and  the  solutions  remained  yellow  under  visible  light  even  when  exposed  to   excess  TFA  or  stronger  acids  (HCl),  indicating  the  lack  of  a  secondary  protonation  event   in  this  receptor.     46         Figure  9.  Fluorescence  emission  of  13  in  neutral  and  TFA-­‐protonated  states  in   acetonitrile.         The  fluorescence  emission  and  excitation  spectra  also  follow  the  trends  seen  in   3,  with  one  notable  exception.  The  relative  PLQY  of  freebase  13  was  found  to  be  21%   (with  L-­‐Tyrosine  as  the  standard),  which  diminished  to  >2%  upon  exposure  to  TFA.  The   basis  for  this  drastic  difference  in  quantum  yield  can  be  illuminated  by  inspection  of  the   crystal  structure  obtained  for  neutral  13  (Figure  10).               Figure  10.  ORTEP  representations  of  13  with  thermal  ellipsoids  drawn  at  the  50%   probability  level.  The  arene-­‐arene  distance  is  3.48  Å,  with  a  slip  offset  of  the  rings  of   1.46  Å.   47             The  high  PLQY  served  as  a  strong  indicator  of  rigidification  of  the  fluorophore   due  to  π-­‐π  stacking  interactions  present  in  the  arms  of  the  neutral  receptor.  Disruption   of  this  interaction  by  protonation  of  the  pyridiyl  N  and  subsequent  inclusion  of  the   counteranion  in  the  cleft  of  the  receptor  could  account  for  the  loss  of  the  emission   efficiency  in  the  protonated  species,  and  the  return  to  an  approximately  2-­‐3%  PLQY,   equivalent  to  the  parent  dianiline.   Ion  binding.  Metal  cations  were  chosen  as  the  targets  for  proof  of  principle   studies  due  to  the  large  volume  of  literature  upon  which  to  base  experiments,  and  the   Johnson  group’s  expertise  with  metal  cation  assemblies.  In  order  to  ascertain  the   feasibility  of  ion  binding  with  13,  solutions  of  the  neutral  species  in  organic  media  were   added  to  solutions  of  Pb(NO3)2,  Ga2(SO4)3,  Zn(NO3)2,  ZnCl2,  and  Zn(BF4)2  salts  and  either   TFA  or  triethylamine  (TEA).  No  obvious  changes  in  the  absorption  spectra  with  both  the   Ga(III)  and  Pb(II)  salts  were  observed,  while  the  Zn  spectra  exhibited  some  distinct  and   promising  changes  (Figure  11).  The  slightly  basic  Zn(II)  solution  exhibits  the  growth  of   the  same  charge  transfer  band  seen  upon  exposure  to  acid,  which  indicated  that  the   receptor  was  binding  Zn(II)  by  lone  pair  donation  from  the  pyridine.  Thus  these   conditions  were  chosen  for  titration  (Figure  12;  Appendix  A).       48       Figure  11.  UV-­‐Vis  spectra  of  solutions  of  13  at  28  µM  (blue  trace),  with  TFA  (red  trace)   and  with  TEA  (orange  trace).  To  these  solutions  were  added  a  stock  solution  of  2.5   equivalents  Zn(NO3)2,  TEA  or  TFA  and  13  such  that  the  receptor  and  TFA/TEA   concentrations  remained  constant.               Figure  12.  UV-­‐Vis  spectra  of  13  at  29uM  in  MeCN  titrated  with  Zn(NO3)2  in  the  presence   of  TEA  (a)  to  1.5  equivs  (b)  to  5  equivs.       a b 49     Titration  of  13  in  acetonitrile  with  zinc  nitrate  results  in  an  increase  in  the  charge   transfer  band  intensity  at  370-­‐420  nm,  and  a  decrease  in  the  intensity  of  the  absorbance   at  285  nm.  This  is  accompanied  by  two  sharp  isosbestic  points  at  269  nm  and  297  nm,   indicating  a  discrete  transition  between  two  differently  absorbing  species  in  solution.   This  behavior  is  observed  up  to  approximately  1.5  equivalents  of  metal  added  in  all   cases.  In  titrations  carried  out  past  1.5  –  2  equivalents  of  metal,  the  charge  transfer   band  stops  increasing  with  each  addition,  but  the  isosbestic  points  are  lost  due  to  a   steady  increase  and  slight  shifts  in  the  absorbance  spectra  across  the  high  energy  range   of  the  spectrum  (265-­‐300  nm).       Figure  13.  Correlation  between  equivalents  of  Zn(NO3)2  added  to  13  in  MeCn  and  the   absorbance  change  in  the  UV-­‐Vis  spectrum  monitored  at  400  nm.         Plotting  an  isotherm  for  the  change  in  absorbance  at  400  nm  with  increasing   concentration  Zn(NO3)2  yields  a  binding  isotherm  that  reaches  a  maximum  at   approximately  1  equivalent  added,  and  then  steadily  decreases  as  excess  metal  is   50     introduced.  The  abnormal  decrease  in  the  isotherm  after  saturation  of  the  receptor   correlates  well  with  the  washing  out  seen  in  the  raw  absorbance  spectra  (i.e.,  molar   absorptivity  change),  and  is  indicative  of  aggregation  in  solution.  Additionally,  the   baseline  increase  in  the  spectra  beyond  450  nm  is  reminiscent  of  Mie  scattering  of   particulates  in  solution  and  supports  the  notion  that  this  receptor  is  undergoing  some   additional,  non-­‐stoichiometric  process  that  precludes  extraction  of  a  binding  constant   from  the  isotherms  obtained  during  these  experiments.       Conclusions         Dianiline  3  was  found  to  exhibit  slight  fluorescence  in  its  neutral  state  but  was   quenched  upon  protonation  of  the  pyridine.  The  quenching  of  fluorescence  was   accompanied  by  a  change  in  color  of  solutions  of  this  receptor  to  a  slight  yellow  due  to   pyridinium  charge  transfer  absorbance.  Protonation  of  the  aniline  moieties  returned  the   solution  to  colorless,  but  did  not  result  in  recovery  of  the  fluorescence  emission.  This   switchability  in  emission  output  was  well  suited  for  sensor  applications,  and  thus  3  was   subsequently  functionalized  to  form  simple  amide  derivatives  with  which  to  probe  the   signaling  ability  of  this  scaffold  as  a  fluorionophore.  The  colorimetric  and  fluorometric   behavior  of  the  parent  dianiline  3  was  conserved  in  all  of  the  amide  derivatives  explored   thus  far.       Difficulties  in  isolating  the  free  thiol  6  from  deprotection  of  precursor  5  led  us  to   synthesize  the  more  sterically  hindered  analog  10.  Deprotection  of  this  system  led  to   almost  quantitative  yields  of  free  thiol  12  which  could  be  easily  oxidized  to  11.   51     Reduction  of  this  compound  back  to  free  thiol  12  remains  a  challenge.  In  spite  of  this,  12   was  shown  to  bind  Hg(II)  in  the  predicted  fashion,  with  a    concomitant  decrease  in   fluorescence  response,  which  is  a  strong  indicator  of  the  future  sensor  applications  of   this  family  of  compounds.     In  much  the  same  way,  salicylamide  13  was  synthesized  and  its  binding  ability   explored  preliminarily.  Due  to  the  strong  π-­‐π  interaction  between  the  pendant  phenyl   rings  in  this  compound  it  is  highly  fluorescent  both  in  solution  and  the  solid-­‐state.   Titration  of  13  with  Zn(NO3)2  in  MeCN  indicated  strong  binding  up  to  a  1:1   stoichiometry,  and  then  non-­‐stoichiometric  assemblies  forming  in  solution.  This   complication  precluded  the  fitting  of  binding  data  from  the  titrations,  but  holds  promise   for  future  cation  probe  development.        Experimental   General  Experimental  Data.  1H  and  13C  NMR  spectra  were  recorded  on  a  Varian   Inova  300  (1H  299.95  MHz,  13C  75.43  MHz),  Varian  Inova  500  (1H  500.10  MHz,  13C  125.75   MHz)  or  Varian  Inova  600  (1H  599.98  MHz,  13C  150.86  MHz)  spectrometer.  Chemical   shifts  (δ)  are  reported  in  ppm  downfield  from  tetramethylsilane  internally  referenced  to   residual  non-­‐deuterated  solvent  present  in  the  sample.  UV-­‐Vis  spectra  were  recorded   using  a  Hewlett-­‐Packard  8453  series  photodiode  array  spectrophotometer  in  1  cm  x  1   cm  cuvets.  Fluorescence  spectra  were  recorded  on  a  Hitachi  F4500  fluorometer   equipped  with  a  Hamamatsu  R928  photomultiplier  tube  or  a  Horiba-­‐Jobin  Yvon   FluoroMax-­‐4  fluorometer  equipped  with  a  Hamamatsu  R268P  phosphorescence   52     photomultiplier  tube.  Quantum  yields  were  obtained  by  comparison  to  known   standards  (quinine  sulfate  and  L-­‐tyrosine).  THF  was  freshly  distilled  from  potassium  and   dichloromethane  from  calcium  hydride  immediately  prior  to  use.  All  other  reagents   were  purchased  commercially  and  used  as  received.  Column  chromatography  was   performed  on  Whatman  reagent  grade  silica  gel  (230-­‐400  mesh).       General  Procedure  for  Cross-­‐coupling.  To  an  Ar  purged  solution  of  haloarene  in   1:1  freshly  distilled  THF/i-­‐Pr2NH  (50  mM  w.r.t.  haloarene)  is  added  CuI  (0.05  equiv)  and   PdCl2(PPh3)2  or  Pd(PPh3)4   (0.03  equiv).   To   this   solution   is   added  alkyne   (1.05  equiv)   in   minimal  THF  dropwise  with  stirring  over  4-­‐8  hours.  Upon  complete  addition  the  reaction   is  stirred  an  additional  3-­‐4  hours  at  which  point  it  is  concentrated  in  vacuo,  taken  up  in   Et2O   and   filtered   through   a   2.5   cm  Celite   pad.   The   remaining   salts   are  washed   thrice   with   Et2O   and   the   organics   combined,   concentrated   and   purified   by   silica-­‐gel   column   chromatography.   2,6-­‐Bis-­‐(2-­‐anilinoethynyl)pyridine  3.  Iodoaniline  1  is  reacted  with  TMSA   according  to  the  General  Procedure  for  Cross-­‐Coupling.  After  purification  by  column   chromatography,  a  suspension  of  TMS-­‐protected  ethynylarene  2  (227  mg,  0.92  mmol)   and  K2CO3  (6  equiv)  in  MeOH  (30  mL)  and  Et2O  (15  mL)  was  stirred  at  rt  and  monitored   by  TLC  until  completion  (15-­‐20  min).  The  solution  was  diluted  with  Et2O  and  washed   thrice  with  water  and  brine.  The  organic  layer  was  dried  over  MgSO4  and  concentrated   in  vacuo.  Without  further  purification,  the  residue  was  taken  up  in  THF  (15  mL)  and   reacted  with  2,6-­‐dibromopyridine  (96  mg,  0.40  mmol),  Pd(PPh3)4  (4.7  mg,  0.04  mmol)   53     and  CuI  (1.5  mg,  0.08  mmol)  according  to  the  General  Procedure.  The  product  was   purified  by  column  chromatography  (3:2  Hex/CH2Cl2)  or  precipitated  by  the  addition  of   hexanes  to  a  saturated  solution  of  3    in  ethyl  acetate  to  afford  3  (135  mg,  81%)  as  a  pale   yellow  crystalline  solid.  Mp:  226  oC.  1H  NMR  (300  MHz,  CDCl3):  ∂  7.64  (t,  J  =  8.1  Hz,  1H),   7.45-­‐7.43  (m,  4H),  7.20  (dd,  J  =8.7,  1.8  Hz,  2H),  6.67  (d,  J  =  8.7  Hz,  2H),  4.35  (br  s,  4H),   1.27  (s,  18H).  13C  NMR  (CDCl3):  ∂  146.31,  143.84,  140.56,  136.36,  129.24,  128.04,   125.73,  114.34,  105.82,  93.11,  87.59,  33.85,  31.31.       Bis-­‐(α-­‐Chloro)amide  4.  To  a  deoxygenated  solution  of  3  (395  mg,  0.94  mmol)   and  TEA  (379  mg,  3.76  mmol)  in  CH2Cl2  (10  mL)stirring  under  Ar  was  added  chloroacetyl   chloride  (571  mg,  5.1  mmol)dropwise.  The  reaction  was  stirred  for  12  h  at  rt  and   monitored  by  TLC  (1:1  Hex/EtOAc).  Upon  completion  the  reaction  was  concentrated  in   vacuo  and  CH2Cl2  (15  mL)  was  added  and  the  solution  transferred  to  a  separatory  funnel.   This  solution  was  washed  with  water  three  times,  brine  and  then  the  organics  were   collected  and  dried  over  MgSO4  before  concentration  in  vacuo.  The  crude  material  was   purified  by  column  chromatography  (1:1  Hex/EtOAc)  to  yield  4  as  a  yellow-­‐brown  solid   (437  mg,  89%).  Mp:  193  oC.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  9.23  (br  s,  2H),  8.30  (d,  J  =  8.3   Hz,  2H),  7.72  (t,  J  =  8.3  Hz,  1H),  7.64  (d,  J  =  2.1  Hz,  2H),  7.52  (d,  J  =  8.1  Hz,  2H),  7.43  (dd,  J   =  8.1,  2.1  Hz,  2H),  4.27  (s,  4H),  1.31  (s,  18H).  13C  NMR  (75  MHz,  CDCl3):  δ  163.62,  147.46,   143.19,  136.83,  135.83,  129.32,  127.87,  126.20,  119.07,  111.15,  94.78,  84.80,  43.21,   34.41,  31.10.  MS  (CI  pos)  m/z  (%):  578  (M+  +4,  15),  577  (M+  +3,  23),  576  (M+  +2,  75),  575   (MH+,  38),  574  (M+,  100);  C33H33Cl2N3O2  (574.54).   54         Bis-­‐(α-­‐Thioacetyl)amide  5.  Potassium  thioacetate  (16  mg,  0.14  mmol)  was  added   as  a  solid  to  a  stirring,  deoxygenated  solution  of  4  (34  mg,  0.06  mmol)  in  DMF  (5  mL).   The  reaction  was  monitored  by  TLC  (1:1  Hex/EtOAc)  until  completion,  approximately  12   h  at  rt.  The  crude  reaction  was  concentrated  in  vacuo  and  filtered  through  a  2.5  cm  silica   plug  (1:1  Hex/EtOAc)  and  purified  by  column  chromatography  to  afford  5  as  an   amorphous  yellow  solid.  Recrystallization  by  diffusion  of  heaxanes  into  EtOAc  afforded   colorless  crystals.  Mp:  94  oC.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.75  (br  s,  2H),  8.28  (d,  J  =  8.7   Hz,  2H),  7.75  (br  s,  3H),  7.58  (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  7.39  (dd,  J  =  8.7,  2.4  Hz,  2H),  3.76  (s,  4H),   2.34  (s,  6H),  1.28  (s,  18H).  13C  NMR  (75  MHz,  CDCl3):  δ  195.20,  166.16,  146.18,  143.31,   136.59,  136.54,  129.38,  127.68,  126.57,  119.45,  110.79,  94.31,  85.15,  34.27,  33.99,   31.05,  30.13.  MS  (CI  pos)  m/z  (%):  656  (M+  +2,  19),  655  (MH+,  44),  654  (M+,  100);   C37H39N3O4S2:  (653.85).         Bis-­‐(α-­‐Mercapto)amide  6.  A  solution  of  4  (72  mg,  0.11  mmol)  in  MeOH  (60  mL)   was  degassed  by  bubbling  N2  through  the  solution  for  15  min.  At  this  point  potassium   carbonate  (70  mg,  0.5  mmol)  was  added  as  a  solid  and  the  suspension  was  stirred  for  1   hr  at  rt  with  constant  N2  bubbling  through  the  solution.  Upon  completion  degassed   dilute  aqueous  HCl  was  added  until  the  pH  was  ~5.  This  solution  was  extracted  thrice   with  CH2Cl2  and  dried  over  MgSO4.  After  filtration,  the  filtrate  was  concentrated  in   vacuo  to  yield  6  as  a  reddish  amorphous  solid  (62  mg,  98%).  Mp:  96  oC,  decomp.  1H-­‐ NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  9.73  (br  s,  2H),  8.37  (d,  J  =  9.3,  2H),  7.68  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.50   (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  7.47  (d,  J  =  8.1  Hz,  2H),  7.39  (dd,  J  =  2.4  Hz,  8.7  Hz,  2H),  3.49  (d,  J  =  9.3   Hz,  2H),  2.31  (t,  J  =  9.3  Hz,  2H),  1.32  (s,  18H).     55         Bunte  salt  8.  To  a  solution  of  4  (240  mg,  0.427  mmol)in  50  mL  20%  H2O  in  EtOH   in  a  100  mL  3-­‐neck  flask  equipped  with  a  stir  bar  and  reflux  condenser  was  added   Na2S2O3  (530  mg,  2.137  mmol).  This  solution  was  refluxed  until  voluminous  precipitate   formed,  approximately  12  h.  Upon  completion  the  reaction  was  distilled  down  to  10  mL   and  the  solids  collected  by  suction  filtration.  The  solids  were  washed  with  cold  EtOH  and   allowed  to  dry  yielding  8  (320  mg,  97%)  as  a  reddish  brown  solid.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  d6-­‐ acetone):  δ  9.84  (br  s,  2H),  8.53  (d,  J  =  8.80  Hz,  2H),  7.97  (t,  J  =  7.88  Hz,  1H),  7.70  (d,  J  =   8.80,  2H),  7.68  (d,  2.99  Hz,  2H),  7.58  (dd,  J  =  2.99,  8.99  Hz,  2H),  3.92  (s,  4H),  1.36  (s,   18H).       Thioketal  9.  Obtained  from  1H-­‐NMR  samples  dissolved  in  d6-­‐acetone  or  by   heating  8  in  acetone.  No  yield  calculated.  1H-­‐NMR  (600  MHz,  acetone-­‐d6):  δ  9.80  (br  s,   2H),  8.48  (d,  J  =  8.9  Hz,  2H),  7.94  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.65  (d,  J  =  7.8  Hz,  2H),  7.48  (d,  J  =  2.5   Hz,  2H),  7.38  (dd,  J  =2.5,  8.9  Hz,  2H),  3.89  (s,  4H),  1.29  (s,  6H),  1.15  (s,  18H).  13C  NMR   (600  MHz,  acetone-­‐d6):  δ  165.35,  144.30,  143.05,  138.02,  137.26,  129.40,  128.91,   125.90,  118.69,  110.65,  95.48,  83.63,  62.05,  40.96,  33.24,  23.22,  14.59.       Bis-­‐(α,α,α-­‐Bromodimethyl)amide.  The  precursor  to  10  was  synthesized  as  4,   using  bromoisobutyryl  bromide  (0.2  ml,  1.8  mmol).  Purification  as  4  yields  the  reddish   amorphous  solid  product  (361  mg,  70%  yield).  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  9.42  (br  s,   2H),  8.32  (d,  J  =  8.99  Hz,  2H),  7.76  (t,  J  =  7.20  Hz,  1H),  7.67  (d,  J  =  2.10  Hz,  2H),  7.56  (d,  J  =   7.49  Hz,  2H),  7.46  (dd,  J  =  2.4,  8.99  Hz,  2H),  2.10  (s,  12H),  1.32  (s,  18H).  13C  NMR  (600   MHz,  CDCl3):  δ  169.94,  147.18,  143.30,  136.80,  136.74,  129.41,  127.81,  126.15,  118.86,   111.26,  94.82,  85.13,  63.31,  34.46,  32.64,  31.24.   56     Bis-­‐(α,α,α-­‐Dimethylthioacetyl)amide  10.  Synthesized  as  5,  from  bis-­‐(α,α,α-­‐ bromodimethyl)amide  above  (150  mg,  0.21  mmol)  and  potassium  thioacetate  (115  mg,   0.92  mmol).  Yields  the  product  (106  mg,  71%)  as  a  yellow  amorphous  solid.  1H-­‐NMR   (300  MHz,  CDCl3):  δ  9.18  (br  s,  2H),  8.35  (d,  J  =  8.99  Hz,  2H),  7.78  (t,  J  =  7.19  Hz,  1H),  7.62   (m,  4H),  7.44  (dd,  J  =  2.39,  8.89  Hz,  2H),  2.26  (s,  12H),  1.31  (s,  18H).  13C  NMR  (600  MHz,   CDCl3):  δ  195.20,  166.16,  146.18,  143.31,  136.59,  136.54,  129.38,  127.68,  126.57,   119.45,  110.79,  94.31,  85.15,  34.27,  33.99,  31.05,  30.13.    Bis-­‐(α,α,α-­‐Dimethylmercapto)amide  11.  Synthesized  in  the  same  manner  as  6   from  10  (100  mg,  0.14  mmol)  and  potassium  carbonate  (43  mg,  0.31  mmol).  Yields  11   (77  mg,  88%)  as  a  yellow  amorphous  solid.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  9.85  (br  s,  2H),   8.34  (d,  J  =  8.69  Hz,  2H),  7.73  (t,  J  =  7.19  Hz,  1H),  7.65  (d,  J  =  2.1  Hz,  2H),  7.56  (d,  J  =  7.80   Hz,  2H),  7.45  (dd,  J  =  2.4,  8.69  Hz,  2H),  1.73  (s,  12H),  1.31  (s,  18H).  13C  NMR  (600  MHz,   CDCl3):  δ  173.36,  146.83,  137.15,  129.24,  127.92,  125.98,  118.91,  118.89,  111.05,  94.66,   85.65,  48.90,  34.45,  31.22,  30.47.   Salicylamide  13.  Representative  synthesis:  To  25  mL  of  dichloromethane  in  a  50   mL  round-­‐bottomed  flask  was  added  3  (100  mg,  0.237  mmol)  and  BOP  (benzotriazolyl   oxytris-­‐(dimethylamino)  phosphonium  hexafluorophosphate)  (315  mg,  0.713  mmol).  To   this  solution  was  added  TEA  (~6  equiv)  and  the  reaction  as  stirred  for  36  h.  Upon   completion  the  crude  reaction  mixture  was  concentrated  in  vacuo,  filtered  through  a  2.5   cm  silica  plug  (1:1  EtOAc/hexanes)  and  concentrated.  This  crude  product  was  purified  by   column  chromatography,  to  yield  pure  13  as  a  colorless  crystalline  solid.  1H-­‐NMR  (300   MHz,  CDCl3):  δ  11.77  (br  s,  2H),  9.61  (br  s,  1H),  8.47  (d,  J  =  8.9,  2H),  7.84  (t,  J  =  8.9  Hz,   57     1H),  7.79  (dd,  J  =  1.8,  8.1  Hz,  2H),  7.66  (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  7.61  (d,  J  =  7.8  Hz,  2H),  7.55   (dd,  J  =  2.4,  8.7  Hz,  2H),  7.20  (m,  2H),  6.92  (m,  4H),  1.39  (s,  18H).  13C  NMR  (600  MHz,   CDCl3):  δ  207.28,  167.12,  160.57,  146.98,  143.21,  137.35,  134.21,  128.48,  126.85,   119.71,  119.33,  118.74,  115.54,  110.66,  95.03,  86.32,  34.50,  31.23.     Bridge  to  Chapter  III       Chapter  III  continues  with  the  synthesis  and  binding  analysis  of  derivatives  of  the   parent  dianiline  scaffold,  specifically  sulfonamide  and  urea  functionalized  receptors.   Focus  is  shifted  from  exploratory  studies  using  the  more  well-­‐known  coordination  of   cationic  metals  presented  in  Chapter  II  to  our  initial  attempts  at  binding  point  charge   halides  and  inorganic  anions  in  competitive  media.  As  reported  in  Chapter  I,  the  binding   energies  of  synthetic  receptors  with  anionic  targets  can  be  relatively  weak,  and  thus   much  attention  will  be  paid  to  identifying  and  minimizing  competing  inter-­‐  and   intramolecular  interactions.  Much  of  the  following  chapter  will  be  devoted  to  the  parent   phenylurea  compound,  as  it  was  identified  as  the  best  foundation  upon  which  to  build   an  understanding  of  the  structure-­‐property  relationships  that  govern  self-­‐assembly  in   this  class  of  molecules.           58       CHAPTER  III     ANION  BINDING:  SELECTIVITY  AND  EFFECTS  ON  SOLID-­‐STATE  CONFORMATION       Introduction       This  chapter  was  coauthored  with  Dr.  Orion  Berryman  and  Dr.  Charles  Johnson,   both  of  whom  provided  crystallographic  support  and  editorial  assistance,  and  Dr.  Sean   McClintock  who  performed  the  molecular  modeling  calculations.  My  advisors  Michael   M.  Haley  and  Darren  W.  Johnson  conceptualized  the  project  and  provided  editorial   assistance  while  Dr.  Lev  N.  Zakharov  solved  the  diffraction  data  for  the  crystal  data   presented  in  the  published  manuscript  (Chem.  Commun.,  2009,  2520-­‐2522,  ©  The  Royal   Society  of  Chemistry).   The  synthesis  and  study  of  hydrogen  bonding  receptors  for  anions  is  an  engaging   challenge  because  of  the  design  difficulties  associated  with  targeting  such  relatively   diffuse,  weakly  basic  and  highly  solvated  analytes.1  The  prevalence  of  systems  in  both   biological  and  supramolecular  research  whose  behavior  is  dictated  by  their  hydrogen   bonding  ability  with  simple  ions  has  also  generated  increased  attention  in  this  field.2  The   development  of  a  modular  design  strategy  for  the  preparation  of  ion  and  molecule   receptors  based  off  of  arylacetylene  cores,  a  well  known  chromophore  and  fluorophore,   inherently  lends  itself  to  facile  synthetic  modification.  The  adaptation  of   phenylacetylene  scaffolding  to  supramolecular  chemistry  has  in  the  past  yielded  a   surprising  array  of  host-­‐guest  and  coordination  complexes,  some  of  which  were  covered   59     in  Chapter  I.3  The  rigid  and  linear  motif  provided  by  the  inclusion  of  arylethynyl  subunits   has  provided  suitable  geometric  dimensions  for  both  macrocyclic  and  acyclic  ligands  and   their  transition  metal  complexes,  as  shown  in  Chapter  II.  Among  the  benefits  of  such   core  structures  is  the  degree  of  preorganization  resulting  from  use  of  the  rigid,   conjugated  components.  Given  the  other  elegant  metal  cation  sensors  that  have  been   developed  utilizing  molecules  such  as  these,4  a  modular  receptor  class  that  targets   anions  based  on  fluorescent  cores  may  offer  a  new  and  improved  approach  to  anion   sensing.  Both  sulfonamides  and  ureas  show  well-­‐known  affinities  for  anions  in  solution,5   and  can  easily  be  coupled  to  a  modular  synthetic  scaffold  built  upon  the  2,6-­‐bis(2-­‐ anilino-­‐ethynyl)pyridine  core  1  (Scheme  1).  Furthermore,  the  ethynylpyridine  core  has   the  added  feature  that  the  protonation  state  of  the  pyridine  nitrogen  can  regulate   binding  geometries  and  selectivities,  and  thus  receptors  that  may  have  been  suitable  for   cationic  guests  could  be  switched  to  select  for  anionic  species  through  both  electrostatic   and  hydrogen-­‐bond  donating  interactions.6     60       Scheme  1.  Sulfonamide  and  urea  synthesis         Scheme  1  illustrates  the  sulfonamides  and  ureas  first  synthesized  by  the  Haley   and  Johnson  groups  in  2006.7  Starting  from  readily  available  1,  sulfonamides  can  be   synthesized  in  extremely  good  yield,  typically  85-­‐95%,  by  treatment  of  the  dianiline  with   commercially  available  sulfonyl  chlorides  in  pyridine.  Ureas  can  be  produced  in  much   the  same  manner;  by  simple  treatment  of  1  with  the  appropriate  isocyanate  in  toluene   the  receptor  compounds  can  be  isolated  in  good  yield,  typically  75-­‐85%.  The  urea   synthesis  suffers  from  some  difficult-­‐to-­‐remove  byproducts,  as  the  homourea  (formed   from  decomposed  isocyanate)  hydrogen  bonds  strongly  with  the  receptors  and  must  be   triturated  away.   Sulfonamides       Owing  to  the  acidity  of  the  sulfonamide  N-­‐H  protons,  we  elected  to  start  our   anion  binding  studies  with  this  class  of  receptor.  We  had  previously  reported  two   61     sulfonamide-­‐based  ethynylpyridine  compounds  that  showed  promise  as  rigid  receptors   for  anions  and/or  water  in  a  [2  +  2]  binding  mode.7  Both  solid-­‐state  and  serial  dilution   experiments  revealed  that  these  receptors  formed  helical,  homodimers  around  two   halide  or  water  guests,  as  well  as  heterodimers  incorporating  both  a  halide  and  a  water   guest,  depending  upon  the  protonation  state  of  the  pyridine  nitrogen.   Unfortunately,  the  complicated  equilibria  present  in  solutions  of  these  receptors   prevented  unambiguous  determination  of  the  host-­‐guest  stoichiometry  outside  of  the   solid-­‐state.  It  was  hoped  that  larger  functional  groups  appended  to  the  pendant  phenyl   rings  of  2  would  serve  two  purposes:  to  simplify  the  binding  data  by  disrupting  the   dimerization  sterically  and  to  provide  a  more  lypophilic  tail  that  would  promote  the   solubility  of  these  receptors,  as  the  dimerization  event  was  blamed  for  their  relatively   low  solubility  in  some  organic  solvents.  Additionally,  a  lypophilic  tail  on  the  protonated   compound  could  allow  the  sulfonamide  receptors  to  serve  as  membrane  transport   agents  for  anions.5       62                     Figure  1.  Illustrations  of  the  dimerization  of  2c  around  (a)  two  water  molecules  (ORTEP   representation  with  ellipsoids  drawn  at  the  50%  probability  level)  and  (b)  a  close  up  of   the  cavity  of  2c  showing  (top  left)  homodimerization  around  water;  (top   right)heterodimerization  around  HCl  and  water,  with  Cl-­‐  shown  in  green;  and  (bottom   panels)  homodimerization  around  HCl  and  HBr,  with  Br-­‐  shown  in  red.7b     a b 63       Scheme  2.  Synthesis  of  new  sulfonamide  receptors  2e,f.         Synthesis  of  2e  and  2f  was  accomplished  under  the  same  conditions  as  the   previous  sulfonamides.  The  starting  sulfonyl  chloride  reagents  were  each  prepared  from   their  respective  commercially  available  benzenesulfonic  acid  sodium  salts  treated  with   18-­‐crown-­‐6  and  cyanuric  chloride  in  acetone.8  The  products  of  these  reactions  were   used  without  purification  or  isolation.  Although  the  solubility  in  organic  solvents  such  as   acetonitrile  and  chloroform  was  increased  by  the  long  alkyl  appendages,  preliminary   binding  studies  with  these  receptors  did  not  result  in  simplified  binding  isotherms  and   still  required  complicated  regressional  analysis  to  fit  a  correct  model  to  the  binding   stoichiometry.     64       Figure  2.  Isotherm  generated  from  plotting  the  absorbance  at  400  nm  in  a  29.1  µM   solution  of  2e  with  tetrabutylammonium  bromide  in  CHCl3.         As  illustrated  in  Figure  2,  the  abnormal  behavior  at  the  start  of  the  binding   isotherm  obtained  from  UV-­‐Vis  titration  data  led  to  poor  fits  when  fitted  by  nonlinear   regressional  analysis  to  a  [1  +  1]  binding  model  because  of  its  position  at  or  near  the   equivalence  point.  This  “blip”  in  the  isotherm  was  reproducible  in  all  of  the  sulfonamide   receptors,  and  may  indicate  the  displacement  of  tightly  bound  water  and  a  fluctuating   population  of  2(2e)·∙2(H2O),  2(2e)·∙(H2O)(TBACl)  and  2(2e)·∙2(TBACl)  complexes  over  the   course  of  the  titration.  It  is  possible  to  fit  the  binding  data  to  a  global  [1  +  1]  binding   model  assuming  the  eventual  distribution  of  host-­‐guest  complexes  is  substantially  [1  +   1]  in  the  presence  of  a  vast  excess  of  titrant.  Ignoring  the  stoichiometric  difficulties  may   also  have  precluded  the  use  of  these  receptors  in  competitive  media;  their  tendency  to   strongly  bind  water  dimers  would  always  compete  with  their  anion  binding  capability.           65     Ureas     We  reasoned  that  an  increase  in  the  number  of  hydrogen  bonding  sites  within  a   convergent  receptor  binding  pocket  would  likely  favor  [1  +  1]  complexation,  and  that   alkylation  of  the  para  positions  of  the  pendant  phenyl  rings  could  increase  the   membrane  transport  potential  of  the  urea  receptors.  To  that  end,  reported  herein  is  the   synthesis  of  the  bisurea  analogues  3c,d  derived  from  1  and  the  solution  and  solid-­‐state   data  of  3a  that  confirm  this  binding  hypothesis  (Scheme  3).       Scheme  3.  Synthesis  of  new  urea  analogs  for  ongoing  membrane  transport  studies.       Slow  evaporation  of  a  MeOH  solution  of  3a  yielded  crystals  suitable  for  x-­‐ray   diffraction  (Figure  3).  Unlike  the  sulfonamide  [2  +  2]  dimers,7  in  which  the  “arms”  wrap   around  the  guest  molecules,  the  solid-­‐state  structure  revealed  that  receptor  3a  adopts   two  different  conformations  –  a  “S”  and  a  “W”  which  stack  in  an  “SWWS”  fashion  with   the  bottom  “SW”  in  a  centrosymmetrical  arrangement  with  respect  to  the  top  “WS”.  In   the  W  form,  a  MeOH  guest  donates  a  hydrogen  bond  to  the  pyridine  nitrogen  while   both  urea  arms  are  pointed  away  from  the  MeOH.  In  the  S  form,  a  second  MeOH   donates  a  hydrogen  bond  to  the  pyridine  nitrogen  and  accepts  two  hydrogen  bonds   66     from  the  urea  N–H  of  one  arm.  Intermolecular  urea  N–H•••O=C  contacts  make  up  the   remainder  of  the  [4  +  4]  “tetrameric”  repeat  unit.  There  are  no  additional  H-­‐bonds   between  these  “isolated”  units.   As  in  the  case  of  the  neutral  sulfonamide  receptors,7  the  neutral  bisurea   receptors  show  an  affinity  for  neutral  guests  (e.g.,  MeOH,  Figure  1).  Protonation  of  the   central  pyridine  nitrogen  activates  strong  anion  binding  in  this  system  as  well.    To   perform  binding  constant  measurements,  the  trifluoroacetate  and  tetrafluoroborate   salts  were  prepared  under  the  assumption  that  these  weakly  basic,  larger  anions  would   not  strongly  compete  for  the  binding  pocket  in  this  receptor.  (Preliminary  molecular   models  had  indicated  halides  were  appropriately  sized  guests.)  Fortunately,  3a•TFA   proved  easy  to  prepare  on  large  scale  as  an  anhydrous,  analytically  pure  crystalline  solid.       Figure  3.  ORTEP  representation  (50%  probability  ellipsoids)  of  the  two  conformers  of   3a·∙MeOH  with  two  solven  molecules  in  different  H-­‐bonding  motifs.  The  “S”  conformer   (orange)  and  the  “W”  conformer  (blue)  show  half  of  the  “SWWS”  tetrameric  repeat  unit.   The  t-­‐butyl  groups  have  been  omitted  for  clarity.  The  N·∙·∙·∙O  distances  (2.890-­‐3.193  Å)  are   typical  for  H-­‐bonds  (dashed  lines).   67           While  a  crystal  structure  of  the  TFA-­‐protonated  urea  has  so  far  proven  elusive,10   DFT  modeling  of  this  complex  indicated  that  the  urea  backbone  was  flexible  enough  to   partially  accommodate  the  CF3CO2–  counterion,  with  one  oxygen  stabilized  by  three   hydrogen  bonds  between  the  central  pyridine,  and  one  urea  arm  (Figure  4).11   Nonetheless,  the  binding  pocket  in  this  model  is  sufficiently  compact  that  the  receptor   arms  must  twist  significantly  from  planarity  to  allow  the  receptor  to  accommodate  such   a  large  guest.  While  smaller  oxoanions  may  fit  more  easily  into  the  binding  pocket  of   protonated  3a,  we  reasoned  that  any  competition  between  the  trifluoroacetate  and   halide  guests  would  favor  the  guest  with  the  greater  number  of  stabilizing  hydrogen   bonds,  i.e.,  the  halide.                 Figure   4.   Top   (left)   and   side   (right)   views   of   the   DFT   calculated   position   of   the   trifluoroacetate  anion  in  protonated  3a.         UV-­‐Vis  spectrophotometric  titrations  of  protonated  3a•TFA  with  Bu4NCl,  Bu4NBr   and  Bu4NI  were  carried  out,  and  the  data  individually  fit  with  the  HyperQuad  2006  suite   68     of  programs  (see  ESI).12  In  comparison  with  the  TFA  salt,  titration  with  the   tetraalkylammonium  salts  showed  a  new  absorbance  band  at  422  nm  which  increased  in   intensity  and  shifted  bathochromically.  Isosbestic  behavior  was  observed  when   sufficient  time  was  allowed  between  aliquots  for  the  system  to  reach  equilibrium  (less   than  3  minutes).  Binding  constants  for  3a  were  obtained  via  titrations  using  1H  NMR   spectroscopy  since  the  UV-­‐Vis  spectra  of  the  neutral  receptor  did  not  exhibit  any   significant  spectroscopic  handle.  These  latter  data  were  fit  to  a  [1  +  1]  model  using   HypNMR  2006.12     As  shown  in  Table  1,  protonation  of  3a  activates  the  halide  binding  ability  of  this   receptor  class.    Whereas  unprotonated  3a  obeys  the  classic  Hofmeister  series,   protonated  3a  strongly  binds  all  three  halides  in  the  range  of  42,700–83,200  M–1.  In  fact,   the  binding  constants  for  bromide  and  iodide  are  two  and  four  orders  of  magnitude   larger  in  the  protonated  receptor  compared  to  the  neutral  receptor.  However,  these  are   apparent  binding  constants  and  a  decrease  in  the  observed  binding  values  from   competition  with  the  trifluoroacetate  counterion  in  the  3a•TFA  receptor  must  be  taken   into  account.       Guest   3aa   3a•TFAb   Cl–   2100   42,700   Br–   400   61,700   I–   not  measurable   83,200                a  1H-­‐NMR  data  b  UV-­‐Vis  data   Table  1.  Calculated  Ka  (M-­‐1)  fit  to  a  [1  +  1]  model.12  Average  values  from  triplicate   measurements  are  shown.  Experimental  errors  are  ca.  10%.   69           Evidence  of  our  target  [1  +  1]  binding  behavior  was  confirmed  in  the  solid  state.   X-­‐ray  quality  crystals  of  2a•HCl,  were  grown  by  addition  of  HCl  to  a  solution  of  3a  in   hexanes/EtOAc.  In  contrast  to  the  free-­‐base  receptor,  the  two  urea  arms  of  3a•HCl   envelop  the  chloride  ion  affording  a  [1  +  1]  host-­‐guest  complex  with  a  total  of  five  N-­‐ H·∙·∙·∙Cl  hydrogen  bonds  (N·∙·∙·∙Cl  distances  3.03-­‐3.66  Å,  Figure  5).       Figure  5.  Top:  ORTEP  representation  of  the  protonated  receptor  3a·∙HCl  with  ellipsoids   at  the  50%  probability  level.  Bottom:  the  dashed  lines  indicate  N-­‐H·∙·∙·∙Cl  hydrogen  bonds   with  distances  in  Å.   3.035   3.635   3.244   3.276   3.659   70           The  neutral  receptor  relies  entirely  upon  the  urea  functionality  for  its  hydrogen   bonding  capabilities,  and  thus  shows  preference  for  the  more  basic  guests.  The  arms  in   the  neutral  receptor  seem  to  be  too  far  apart  to  participate  effectively  in  cooperatively   stabilizing  the  guest,  and  exhibit  both  the  S  and  W  forms,  while  the  U-­‐shaped  [1  +  1]   complex  is  not  observed.  In  contrast  to  the  neutral  receptor,  3a•TFA  has  a  well-­‐defined   binding  pocket.  The  pyridinium  hydrogen  provides  a  third  point  of  contact,  which   anchors  the  receptor  arms  in  the  desired  conformation  upon  guest  binding  and   converges  all  available  hydrogen  bonds  to  the  binding  pocket.  This  disrupts  the   intermolecular  hydrogen  bond  network  that  held  the  neutral  tetrameric  complex  intact   and  yields  the  [1  +  1]  complex  while  disfavoring  our  previously  observed  [2  +  2]  dimeric   and  “SWWS”  tetrameric  complexes.7  The  slight  preference  for  the  less  basic  Br–  and  I–   anions  over  Cl–  could  be  attributed  to  a  larger  binding  pocket  in  the  U-­‐shaped   conformation,  which  mitigates  the  traditional  bias  in  binding  more  basic  anions  to  favor   the  larger  halides.     Conclusions       We  have  synthesized  and  performed  a  preliminary  analysis  on  a  new  class  of   hydrogen  bonding  receptors  for  halide  anions,  based  off  of  an  inherently  fluorescent   arylacetylene  core.  Bisurea  receptor  3a  binds  chloride,  bromide  and  iodide  and  fit  with   good  agreement  to  a  [1  +  1]  model,  which  significantly  simplifies  the  solution  studies  of   this  receptor  class  relative  to  the  previously  reported  sulfonamide  analogues.   71     Protonation  of  the  pyridyl  nitrogen  in  the  receptor  increases  the  association  constant  by   more  than  an  order  of  magnitude  over  the  freebase  receptor,  and  alters  the  selectivity   between  the  larger  halides  and  chloride.  The  increasing  discovery  of  anionic   contaminants  in  the  environment,  and  the  facile  mobility  of  anions  in  natural  systems,   makes  developing  new  approaches  for  anion  sensing  and  binding  vitally  important.   These  modular  receptors  offer  potential  long-­‐term  applications  in  the  design  of  new   materials  for  remediation  and  sensing  and  the  development  of  new  molecular  probes   for  anions.     Experimental   General  Experimental  Data.  1H  and  13C  NMR  spectra  were  obtained  on  a  Varian   300  MHz  spectrometer  (1H  299.95  Hz,  13C  75.43  Hz)  or  Inova  500  MHz  spectrometer  (1H   500.10  MHz,  13C  125.75  MHz).  Chemical  shifts  (δ)  are  expressed  in  ppm  downfield  from   tetramethylsilane  (TMS)  using  non-­‐deuterated  solvent  present  in  the  bulk  deuterated   solvent  (CDCl3:  1H  7.26  ppm,  13C  77.0  ppm;  THF-­‐d8:  1H  3.58  ppm  13C  67.57  ppm).  Unless   otherwise  specified,  solvents  were  obtained  from  distillation  using  published  literature   procedures  directly  before  use.  X-­‐ray  crystal  data  were  obtained  on  a  Bruker  AXIS  CCD   diffractometer.       Titration  Data.  Spectra  and  the  binding  isotherms,  as  well  as  the  conditions  for   the  titration  experiments  are  reported  in  Appendix  B.     72     p-­‐Butylbenzylsulfonamide  2e.  In  a  flame-­‐dried  25  mL  round  bottom  flask   equipped  with  a  nitrogen  inlet  and  magnetic  stir  bar  dianiline  1  (150  mg,  0.356  mmol)   was  treated  with  p—butylbenzenesulfonyl  chloride  (414  mg,  1.78  mmol)  in  5  mL   anhydrous  pyridine  and  allowed  to  stir  for  12  hr  at  rt.  The  reaction  was  concentrated  in   vacuo  and  run  through  a  short  (2.5  cm)  silica  plug  (1:1  hexanes/EtOAc).  The  eluent  was   concentrated  to  yield  a  yellow  oil  (284  mg,  98%).  1H  NMR  (300  MHz,  CDCl3):  ∂  7.75  (d   and  t,  J  =  7.9  Hz,  indistinguishable,  5H),  7.53-­‐7.35  (m,  10H),  7.20  (d,  J  =  7.9  Hz,  4H),  2.58   (t,  J  =  7.5  Hz,  4H),  1.51  (pentet,  J  =  7.5  Hz,  4H),  1.27  (s,  18H),  0.873  (t,  J  =  7.5  Hz,  6H).  13C   NMR  (CDCl3):  ∂  149.05,  147.96,  143.32,  136.99,  136.77,  135.91,  129.98,  129.26,  128.18,   127.58,  126.82,  120.78,  113.30,  93.89,  85.60,  35.75,  34.64,  33.27,  31.38,  22.45,  14.12.     p-­‐Octylbenzylsulfonamide   2f.   In   a   flame-­‐dried   25   mL   round   bottom   flask   equipped   with   a   nitrogen   inlet   and   magnetic   stir   bar   was   added   10   mL   anhydrous   acetone  and  cyanuric  chloride  in  small  quantities  until  bubbling  stopped  (~10  mg,  0.054   mmol).  To  this  was  added  p-­‐octylbenzenesulfonic  acid  sodium  salt  (500  mg,  1.71  mmol)   and   18-­‐crown-­‐6   (22  mg,   0.09  mmol)   before   slow   addition   of   the   bulk   of   the   cyanuric   chloride  (346  mg,  1.88  mmol).  The  flask  was  equipped  with  a  condenser  and  allowed  to   reflux   to   completion,   ~20   hr   during   which   voluminous   white   solid   formed.   Upon   completion   the   reaction   was   concentrated   in   vacuo   and   taken   back   up   in   5   mL   dry   pyridine.   To   this   suspension   was   added   dianiline   1   (150   mg,   0.356   mmol)   which   immediately   changed   the   chalky   white   suspension   to   orange.   The   reaction   was   monitored  by  TLC  (1:1  hexanes/EtOAc)  until  complete,  ~15  min.  The  reaction  was  then   concentrated   in   vacuo   and   run   through   a   2.5   cm   silica   plug   (100%   CH2Cl2)   and   73     concentrated  to  yield  2f  as  a  white  waxy  solid  (316  mg,  96%)    1H  NMR  (300  MHz,  CDCl3):   ∂  7.76  (d,  J  =  8.4  Hz,  4H),  7.76  (t,  J  =  7.2  Hz,  1H)  7.53-­‐7.35  (m,  10H),  7.19  (d,  J  =  8.4  Hz,   4H),  2.59  (t,  J  =  7.3  Hz,  4H),  1.53  (br  pentet,  4H),  1.28  (s,  18H),  0.872  (t,  J  =  7.3  Hz,  6H).   13C   NMR   (CDCl3):   ∂   149.12,   147.88,   143.31,   136.98,   136.79,   135.96,   129.94,   129.26,   128.23,  127.59,  126.74,  120.49,  113.06,  93.80,  85.47,  36.09,  34.64,  32.07,  31.38,  31.20,   29.61,  29.43,  22.89,  14.34.   Phenylurea  3a.  All  glassware  was  flame-­‐dried  before  use.  Dianiline  1  (800  mg,   1.9  mmol)  was  reacted  with  phenyl  isocyanate  (3  equiv)  in  10  mL  toluene  with  stirring   for  3  h  under  N2.  Following  concentration  in  vacuo,  the  crude  product  was  filtered   through  a  short  silica  plug  (2:1  hexanes/CHCl3).  Trituration  with  Et2O  afforded  3a  (1.15g,   92%)  as  a  fluffy  white  powder.  Mp:  212-­‐215  °C.  1H  NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.32  (br  s,   2H),  8.07  (d,  J  =  4.8  Hz,  2H),  7.74  (br  s,  2H),  7.47-­‐7.28  (m,  11H),  7.15  (t,  J  =  4.5  Hz,  4H),   6.92  (t,  J  =  4.5  Hz,  2H),  1.29  (s,  18H).  13C  NMR  (CDCl3):  δ  152.95,  145.38,  144.62,  141.17,   140.40,  138.15,  10.11,  129.56,  128.78,  127.65,  122.94,  120.33,  114.49,  110.45,  94.38,   87.33,  35.01,  31.75.  MS  (APCI)  m/e  660.3  (M+,  100).   Phenylurea  3a•TFA  Freebase  phenylurea  3a  (200  mg,  30.3  mmol)  was  dissolved   in  CHCl3  (15  mL)  and  a  solution  of  trifluoroacetic  acid  in  CHCl3  (5  mL,  1.5  M)  was  added.   The  bright  yellow  solution  was  evaporated  to  ~10  mL,  and  pentane  was  added  to   precipitate  the  product  as  a  bright  orange,  amorphous  solid.  Recrystallization  from   CHCl3/pentane  yields  an  orange,  crystalline  solid.  1H-­‐NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  9.35  (br  s,   1H),  8.47  (br  s,  2H),  8.31  (br  s,  2H),  8.26  (t,  J  =  8.4  Hz,  1H),  8.15  (br  s,  1H),  7.85  (br  m,   74     2H),  7.62  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  7.56-­‐7.47  (m,  8H),  7.17  (br  m,  2H),  6.98  (br  s,  1H),  6.91  (br  s,   1H),  1.32  (s,  18H).   p-­‐Octylphenylurea  3c.  As  procedure  for  3a.  Dianiline  1  (350  mg,  0.831  mmol)   was  reacted  with  p-­‐octylphenyl  isocyanate  (576  mg,  2.49  mmol)  in  10  mL  of  toluene.   Upon  completion  the  reaction  was  concentrated  in  vacuo  and  filtered  through  a  2.5  cm   silica  plug  (2:1  hexanes/EtOAc).  Following  trituration  with  Et2O  3c  was  obtained  (560   mg,  77%)  as  a  waxy  solid.  1H  NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  8.26  (br  s,  2H),  8.05  (d,  J  =  8.4  Hz,   2H),  7.64  (br  s,  2H),  7.35-­‐7.27  (m,  9H),  7.20  (m,  2H),  6.94  (d,  J  =  8.4  Hz,  4H),  2.49  (t,  J  =   8.4  Hz,  4H),  1.50-­‐1.46  (m,  4H),  1.31-­‐1.21  (m,  38H),  0.88  (t,  J  =  7.2  Hz,  6H).  13C  NMR  (600   MHz,  CDCl3):  δ  153.19,  144.90,  142.75,  138.36,  138.01,  135.80,  128.73,  128.67,  128.04,   126.01,  120.28,  118.87,  109.52,  93.04,  87.68,  35.27,  34.18,  31.90,  31.23,  29.49,  29.28,   22.66,  14.11.   p-­‐Heptyloxyphenylurea  3d.  As  procedure  for  3a.  Dianiline  1  (120mg,  0.285   mmol)  was  reacted  with  p-­‐heptyloxyphenyl  isocyanate  (199  mg,  0.855  mmol)  in  10  mL   anhydrous  toluene.  The  reaction  was  monitored  by  TLC  (2:1  hexanes/EtOAc)  until   completed,  ~4  hr  at  rt.  Upon  completion  the  reddish  suspension  turned  to  a  clear   orange  solution.  The  reaction  was  then  concentrated  in  vacuo  and  filtered  through  a  2.5   cm  silica  plug.  Concentration  of  the  filtrate  and  recrystallization  from  hot  EtOH  yields  3d   (207  mg,  82%)as  a  fine  white  powder.  1H  NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  8.147  (d,  J  =  8.9  Hz,   2H),  7.59  (br  s,  2H),  7.45  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.43  (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  7.37  (dd,  J  =  2.4,  6.0   Hz,  2H),  7.28  (d,  J  =  8.6  Hz,  4H),  7.20  (d,  J  =  7.8  Hz,  2H),  6.71  (d,  J  =  8.9  Hz,  4H),  3.78  (t,   7.20  Hz,  4H),  1.70  (pentet,  J  =  7.20  Hz,  4H),  1.40-­‐1.24  (m,  36H),  0.89  (t,  J  =  6.0  Hz,  6H).   75     13C  NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  155.98,  153.32,  145.09,  142.81,  138.44,  130.61,  126.17,   123.30,  119.00,  114.94,  109.63,  93.28,  87.23,  68.21,  34.22,  31.77,  31.24,  29.09,  25.99,   22.60,  14.08.     Bridge  to  Chapter  IV   This  chapter  focused  on  the  anion  binding  ability  of  the  parent  phenylurea   receptor,  while  Chapter  IV  focuses  on  our  work  to  develop  these  compounds  into   fluorogenic  probes  for  anions  by  examining  the  optoelectronic  properties  in  their   neutral  and  protonated  forms.  Functionalization  of  the  sulfonamide  receptors  with   electron  donating  and  withdrawing  groups  was  shown  to  switch  these  receptors  from   “ON-­‐OFF”  to  “OFF-­‐ON”  fluorescence  reporters  upon  protonation  of  the  central  pyridine   with  appropriate  acids.  The  expansion  of  this  trend  into  the  urea  compounds  by   synthesis  of  analogs  of  the  sulfonamide  compounds,  examination  of  their  fluorescence   by  protonation  with  appropriate  acids,  probing  of  their  excimer/exciplex  emission  and   solvatochromic  effects  arising  from  solvent  disruption  of  receptor  complexes  will  be   reported  in  Chapter  IV.       76       CHAPTER  IV     ANION-­‐DEPENDENT,  SWITCHABLE  ON-­‐OFF  AND  OFF-­‐ON  FLUORESCENCE  EMISSION  IN   BIS(ANILINOETHYNYL)PYRIDINE  DERIVATIVES     Introduction       This  chapter  was  coauthored  with  Brian  Coombs,  who  provided  assistance  with   synthesis,  the  fluorescence  experiments  and  valuable  mechanistic  insight;  Dr.  Sean   McClintock,  who  performed  the  DFT  calculations  in  support  of  experimental  evidence;   Dr.  Charles  A.  Johnson  II,  who  synthesized  the  sulfonamide  compounds  and  first   reported  their  fluorescence  behavior  in  his  dissertation;  Dr.  Orion  B.  Berryman,  who   provided  editorial  assistance  and  my  advisors,  Profs.  Darren  W.  Johnson  and  Michael  M.   Haley,  both  of  whom  provided  editorial  assistance  and  direction  on  the  final  manuscript   published  in  Chemical  Communications  (2011,  47,  5539-­‐5541,  ©  The  Royal  Society  of   Chemistry).         A  great  deal  of  effort  has  been  devoted  to  tailoring  photoactive  switches  on  the   molecular  level  for  use  in  applications  from  biological  imaging  to  molecular  logic  gates   and  photodynamic  therapy.1,2  In  particular,  advances  in  our  understanding  of   intermolecular  luminescence  processes  have  led  to  elegant  multicomponent   supramolecular  switches  and  probes  with  nanomolar  sensitivity  for  anions,  which  have   been  the  subject  of  many  detailed  reviews.3  Fluorescence  as  a  sensing  mechanism  is   desirable  due  to  its  inherent  sensitivity  and  relative  ease  of  measurement  with  common   77     laboratory  equipment.  These  sensors  are  often  modulated  by  pH,  with  the  protonation   or  deprotonation  of  incorporated  heterocycles  as  a  common  fluorescence  ON–OFF,  or   more  rarely  OFF–ON,  switching  motif.4,5  Additionally,  the  tunable  luminescence   properties  of  simple  organic  photoswitches  have  led  to  systems  capable  of  responding   to  multiple  inputs  or  outputs,  which  has  opened  the  way  to  entirely  organic  logic  gates.5   However,  these  structures  are  commonly  engineered  to  exploit  a  single,  distinct   fluorescence  phenomenon  (e.g.,  polarity  dependent  emission  shifting  or  PET  quenching   upon  binding  a  guest)  or  colorimetric  changes  as  their  signaling  events,  and  can  thus  be   limited  in  the  flexibility  of  their  application.  Consequently,  there  persists  a  need  for   selective,  small-­‐molecule  organic  systems  with  discrete,  easily  tunable  negative  and   positive  fluorescent  responses.  Herein  we  report  the  development  of  a  compact   fluorescent  scaffold  easily  derivatized  to  yield  switchable  ON–OFF  and  OFF–ON   responsive  compounds.       78     NtBu NH HN tBu NHO OHN R R NtBu NH HN tBu S SO O O O R R 2 R = H 3a R = OMe 3b R = NO2 4a R = OMe 4b R = NO2 NtBu NH2 H2N tBu 1   Figure  1.  Structures  of  2,6-­‐bis(2-­‐anilinoethynyl)pyridine  receptor  core  1,  urea  (2-­‐3b)  and   sulfonamide  (4a,b)  derivatives.     Chapter  III  reported  the  synthesis  and  halide  binding  studies  of  the  parent   phenylurea-­‐substituted  receptor  2  (Fig.  1)  with  a  series  of  tetrabutylammonium   halides.6  During  the  preparation  and  characterization  of  the  trifluoroacetic  acid  (TFA)   salts  of  the  protonated  receptors,  we  found  that  the  fluorescence  of  the  arylacetylene   core  1  and  phenylurea  2  were  both  quenched  upon  protonation  in  CHCl3.  This  occurred   concurrently  with  a  change  in  the  solution  from  colorless  to  yellow  (Fig.  2).  This  change   in  solution  color  is  seen  in  the  UV-­‐visible  spectrum  as  a  charge  transfer  absorbance  band   from  ca.  450–500  nm  and  is  indicative  of  protonation  at  the  pyridine  nitrogen,  which  has   been  noted  in  similar  systems.7   79       Figure  2.  UV-­‐Vis  spectra  of  1  and  2a  as  both  protonated  and  neutral  receptors  ([H]  or   [H+]  =  12µM).  Inset  is  a  visual  depiction  of  the  change  in  solution  colors  upon   protonation/deprotonation.       Effects  of  Electronic  Modulation  on  Fluorescence  Emission   Due  to  our  interest  in  fluorescent  anion  sensors,  we  have  explored  how   donor/acceptor  functionalization  could  influence  the  binding  strengths  and   optoelectronic  responses  of  the  core  dianiline  1.  Consequently,  we  prepared  hydrogen   bonding  electron-­‐rich  and  electron-­‐poor  ureas  3a,b  and  sulfonamides  4a,b  (Fig.  1).  We   reasoned  that  electron  deficient  receptors  would  possess  a  higher  binding  affinity  for   anionic  guests  and  thus  expected  changes  in  fluorescence  upon  protonation,  much  like   the  parent  compounds.  In  electron-­‐rich  systems  3a  and  4a,  protonation  with  TFA  gave   yellow  solutions,  and  the  fluorescence  emission  was  indeed  quenched  (Fig.  3).     +H+ -H+ 80         Figure  3.  Normalized  emission  spectra  of  both  the  neutral  and  protonated  electron-­‐rich   receptors  ([H]  and  [H+]  =  12  µM,  excitation  1:  360  nm;  2,  3a,b:  343  nm;  4a:  338  nm).     Figure  4.  Normalized  emission  of  electron-­‐poor  receptors  both  neutral  and  protonated   with  TFA  or  HCl  ([H]  and  [H+]  =  12  µM,  excitation  3b:  360  nm;  4b:  365  nm).     81     In  both  these  and  the  parent  systems,  the  residual  emission  peak   bathochromically  shifted  only  when  Cl-­‐  was  present  as  the  counterion  (see  Appendix  C   for  spectra  of  1–3a,  4a  with  Cl-­‐,  as  well  as  UV-­‐visible  and  excitation  spectra).  In  the  case   of  ureas  2·∙TFA  and  3a·∙TFA,  the  fluorescence  spectra  showed  a  second  weak,   hypsochromically  shifted  peak  below  400  nm,  but  this  additional  feature  occurred  only   when  CF3CO2-­‐  was  present  as  the  counterion.       In  contrast  to  electron-­‐rich  3a  and  4a,  electron-­‐poor  analogues  3b  and  4b  were   non-­‐fluorescent  in  the  freebase  form.  Protonation  with  TFA  also  resulted  in  yellow   solutions,  but  significantly  increased  the  fluorescence  maxima  at  ~515–555  nm  (Figure   4).  To  examine  the  effect  of  the  counterion,  receptors  3b  and  4b  were  then  treated  with   gaseous  HCl,  as  Cl-­‐  is  known  to  bind  much  more  strongly  than  CF3CO2-­‐.  The  resultant,   excimer-­‐like  fluorescence  (Figure  4,  dash-­‐dot  lines)  occurred  at  the  same  wavelength  as   the  residual  fluorescence  in  the  quenched  2·∙TFA,  2·∙HCl,  3a·∙HCl  and  4a·∙HCl  receptors.   These  data  were  corroborated  by  the  addition  of  Bu4NCl  to  the  TFA-­‐protonated   receptors,  which  produced  the  same  emission  bands  observed  upon  addition  of  gaseous   HCl  to  the  neutral  receptor  (i.e.,  bathochromic  shifts  in  the  emission  bands).       Figure  5  visually  illustrates  the  very  simple  trends  observed  in  both  the  urea  and   sulfonamide  derivatives  of  1:  colorless  solutions  turn  yellow  upon  exposure  to  acid   regardless  of  the  proton  source  and  arene  substituent.  Electron-­‐donating  substituents   on  the  pendant  phenyl  rings  afford  compounds  that  are  fluorescent  (ON)  in  the  neutral   state  and  quenched  (OFF)  when  protonated.  On  the  other  hand,  substitution  with   electron-­‐withdrawing  groups  furnishes  a  weakly  fluorescent  freebase  receptor  (OFF)   82     with  greatly  enhanced  fluorescence  (ON)  and  equivalent  red  shifting  in  the  emission   spectra  upon  exposure  to  acids  with  appropriately  sized  conjugate  bases.                 Figure  5.  Colorless  solutions  of  neutral  compounds  in  CHCl3  turn  yellow  upon   protonation  (top);  fluorescence  (excitation  365  nm)  is  quenched  in  electron-­‐rich  systems   3a,  4a  and  “turned  on”  in  electron  poor  systems  3b,  4b  (bottom).       Table  1.  Absolute  photoluminescent  quantum  yields  of  the  freebase  and  protonated   receptors  obtained  with  a  Horiba-­‐Jobin  Yvon  integrating  sphere  in  O2-­‐containing  CHCl3.       These  trends  are  also  mirrored  by  the  experimentally  determined  quantum   yields  in  Table  1.  For  example,  receptor  3b  experiences  a  near  full  order  of  magnitude   increase  in  its  OFF–ON  fluorescence  response  when  Cl-­‐  is  the  counterion  present,  even   when  pre-­‐protonated  with  TFA.     1   2   3a   3b   4a   4b   Freebase   2.26%   0.3%   8.3%   0.09%   3.04%   0.16%   TFA   1.84%   0.04%   0.05%   2.16%   1.02%   0.36%   HCl   1.65%   0.02%   0.01%   12.6%   0.69%   2.14%   3a 3b 3a·HCl 3b·HCl 3a 3b 3a·HCl 3b·HCl 4a 4b 4a·HCl 4b·HCl 4a 4b 4a·HCl 4b·HCl 83       Calculations.  Frontier  molecular  orbital  calculations  (B3LYP/6-­‐31G*  level  of  theory)   provide  insight  into  the  mechanisms  behind  the  behavior  of  the  freebase  receptors.8   Compounds  3a  and  4a  have  nearly  equivalent  lowest-­‐unoccupied  molecular  orbital   (LUMO)  maps,  while  the  highest-­‐occupied  molecular  orbital  (HOMO)  maps  are   significantly  different,  although  still  overlap  with  the  LUMO  on  the  tri-­‐substituted  arene   rings  (Figure  6).  In  both,  excitation  retains  electron  density  near  the  central  alkynyl   system,  resulting  in  radiative  de-­‐excitation  and  thus  emission.  In  3b  and  4b,  however,  a   charge-­‐transfer  fluorescence  state  is  generated,  resulting  in  quenched  fluorescence,   similar  to  other  known  arylacetylene  scaffolds.7  The  fluorescence  OFF–ON  response   seems  to  be  intramolecularly  excimeric  in  nature,  with  this  emission  having  an  intriguing   dependence  on  counterion,  which  warrants  further  study.       Further  Functionalization  of  Urea  Receptors       It  could  be  argued  that  both  the  electron-­‐rich  and  electron-­‐poor  sulfonamide   and  urea  derivatives  of  1  share  the  same  “OFF-­‐ON”  and  “ON-­‐OFF”  behavior  only   because  of  the  nature  of  the    functional  group  used  and  not  the  overall  electron-­‐ rich/poor  nature  of  the  receptor  (i.e.,  both  classes  of  receptor  have  only  either  the   methoxy  or  nitro  functional  group).  In  order  to  expand  upon  this  trend,  receptors  3c-­‐e   were  synthesized  (Scheme  1).     84         Figure  6.  Calculated  frontier  molecular  orbitals  for  neutral  ureas  3a,b  and  sulfonamides   4a,b.  Non-­‐overlapping  HOMO  and  LUMO  orbitals  in  the  electron-­‐acceptor  substituted   systems  results  in  charge  transfer  quenching  of  the  neutral  receptors.     85         Scheme  1.  Synthesis  of  additional  electron-­‐rich  and  electron-­‐poor  receptors.     Investigation  of  the  fluorescence  emission  dependence  upon  protonation  state   in  these  receptors  revealed  the  expected  trend  in  behavior:  regardless  of  the  functional   group,  electron—rich  arenes  appended  to  the  urea-­‐substituted  scaffold  yielded  “ON-­‐ OFF”  responsive  receptors  while  electron-­‐poor  arenes  were  “OFF-­‐ON”  responsive   (Figure  7).     Figure  7.  Normalized  mission  of  electron-­‐rich  receptor  3c  and  its  TFA  and  HCl  salts  along   with  the  alkylated  receptor  3f  and  its  TFA  and  HCl  salts  ([H]  and  [H+]  =  21  µM,  ex  =  363   nm).   86         Figure  8.  Normalized  emission  spectra  of  electron-­‐poor  analogs  (conditions  equivalent   to  those  in  Figure  7).             The  data  presented  in  Figures  7  and  8  are  in  good  agreement  with  the  observed   trend  in  receptors  3a,b  and  4a,b  with  the  exception  of  the  magnitude  of  the  quenching   event  in  receptors  3c  and  3f.  In  the  case  of  3c  this  can  be  attributed  to  very  inefficient   fluorescence  emission  in  the  neutral  state,  thus  upon  protonation  with  either  acid  the   emission  intensity  changes  very  little  from  that  of  the  neutral  compound.  For  3f,   however,  the  emission  is  very  intense  for  3f  and  3f·∙HCl,  but  significantly  quenched  in   3f·∙TFA.  This  “ON-­‐OFF-­‐ON”  response  is  promising  for  the  application  of  this  type  of   receptor  to  pH-­‐independent  sensor  applications  as  it  could  function  as  an  OFF-­‐ON  or   ON-­‐OFF  sensor  across  the  pH  scale.  Additionally,  it  can  be  seen  that  all  of  the  receptors   experience  an  increase  in  intensity  when  the  counterion  is  Cl-­‐  instead  of   87     trifluoroacetate.  This  observation  raised  questions  about  the  mechanisms  of  both  the   “ON-­‐OFF”  and  “OFF-­‐ON”  events,  and  how  a  full  mechanistic  understanding  could  be   exploited  to  increase  the  Cl-­‐  selectivity.     Mechanistic  Investigation  of  the  “OFF-­‐ON”  Response       In  the  majority  of  pyridine-­‐containing  fluorophores,  the  non-­‐bonding  lone-­‐pair   located  at  the  pyridine  nitrogen  offers  a  low  energy  n-­‐π*  absorbance  pathway  to  the   excited  state  that  can  be  disallowed  by  protonation  of  the  pyridine.9  This  low-­‐lying  n-­‐π*   absorbance  is  characterized  by  low  molar  absorptivities,  and  has  the  ultimate  effect  of   lowering  the  fluorescence  quantum  yield  in  fluorophores  of  this  type.9a  Hydrogen   bonding  to  the  lone  pairs    or  protonation  of  the  pyridine  removes  the  contribution  of   the  non-­‐bonding  electrons  of  pyridine  to  the  molecular  absorbance,  and  can  result  in  an   inversion  of  the  n-­‐π*  and  π-­‐π*  transitions  which  in  general  leads  to  an  increase  in   photoluminescent  quantum  yield.  However,  pyridinium  groups  (either  H-­‐protonated  or   methylated)  have  the  additional  effect  of  being  strong  fluorescence  quenchers  due  to   their  highly  electron-­‐accepting  nature.10  Intriguingly,  pyridinium  dimers  have  been   known  to  exhibit  excimeric  fluorescence  through  intermolecular  or  tethered   intramolecular  interactions  in  restricted  environments,  i.e.  solid  matrices  or  covalent   polymers.11       In  many  imaging  applications,  the  “OFF-­‐ON”  response  is  desirable  due  to  the  low   background  fluorescence  and  the  inherent  increase  in  resolution  when  observing  the   appearance  of  signal  rather  than  the  disappearance.4  Of  importance  in  this  type  of   88     system  is  the  quenching  mechanism  that  dictates  the  “OFF”  phase  of  a  sensor’s   response,  and  critical  to  these  quenching  events  is  the  possibility  of  inter-­‐  versus   intramolecular  interactions.  Unlike  intramolecular  charge  transfer  emission,   intermolecular  excimeric  emission  is  a  diffusion  limited  process.9,11  If  there  is  no   intermolecular  interaction  during  the  lifetime  of  the  excited  state,  then  no  emission   occurs.  In  non-­‐excimeric  fluorescence,  the  change  in  emission  must  come  from   interaction  with  the  target  analyte  and  result  in  changes  to  the  charge  transfer  or   electron  transfer  processes  along  the  fluorophore’s  conjugation  length,  in  our  case  the   phenylethynyl  core.  The  absolute  concentration  of  the  probe  would  have  only  a  single   effect  on  the  fluorescence  output  of  sensors  of  this  type:  affecting  the  intensity  of  the   sensor  emission  linearly  with  concentration.     On  the  other  hand,  excimeric  fluorescence  only  arises  when  the  receptor  is  at  a   local  concentration  high  enough  to  undergo  excited-­‐state  intermolecular  interactions,   and  the  concentration  of  the  receptor  and  its  excited-­‐state  lifetime  then  become  the   dominant  considerations  in  determining  emissivity.  Both  of  these  factors  have  direct   implications  on  whether  or  not  the  fluorionophore  would  function  as  an  effective  probe;   especially  large  are  the  implications  for  in  vitro  or  in  vivo  probe  design  as  it  is  difficult  to   control  quantitatively  the  concentration  of  a  probe  within  cellular  compartments.  Due   to  the  differences  in  the  function  of  sensors  designed  upon  each  of  these  two  types  of   emission  pathway,  it  became  critical  for  us  to  ascertain  the  mechanism  of  the   fluorescence  emission  event  in  our  receptors  in  order  to  intelligently  manipulate  sensor   design.     89     Our  approach  was  to  determine  the  ground-­‐state  association  of  3a  and  3b  in   solution,  which  would  allow  for  determination  of  monomer  or  oligomer-­‐dependent   emission.  These  data  could  then  be  related  to  the  solvatochromic  behavior  of  the   receptors,  with  an  eye  toward  modulation  of  the  receptor  design  in  order  to  increase   quantum  efficiency  and  sensitivity  in  biologically  relevant  media.     Self-­‐association  in  Ureas.  The  following  analysis  was  carried  out  primarily  on   compounds  3a  and  3b,  as  they  exhibit  the  greatest  responses  to  anion-­‐induced   fluorescence  switching.  As  shown  earlier  in  this  chapter,  neutral  3a  was  found  to  form  [4   +  4]  tetrameric  stacks  of  mirror-­‐image  dimers.  In  order  to  probe  the  solution  behavior  of   this  receptor  dilution  experiments,  ROESY-­‐NMR,  DOSY-­‐NMR  and  mass  spectroscopy   experiments  were  undertaken,  in  all  cases  using  water-­‐saturated  solvents  in  order  to   limit  the  number  of  variables  between  samples.         Methoxyphenylurea  3a.  Attempts  to  determine  dimerization  constants  from  1H-­‐ NMR  experiments  starting  at  the  limit  of  solubility  of  3a  in  CDCl3  were  unsuccessful.   While  small  upfield  shifts  were  observed  in  the  spectra  during  dilution,  the  low   concentrations  achieved  before  the  spectra  stopped  shifting  exceeded  the  sensitivity   limits  of  the  instrument  (see  Appendix  C).  Dilution  experiments  by  UV-­‐Vis  also  yielded   inconclusive  results,  making  it  possible  that  3a  was  either  not  self-­‐associating  or   associating  extremely  tightly  in  solution.     90       Figure  9.  1H-­‐NMR  projection  and  2-­‐D  ROESY  spectrum  of  3a  at  3.4  mM,  showing  the   apparently  weak  NOE  that  indicated  self-­‐association  in  solution  (see  Appendix  C  for   additional  spectra  and  assignments).         In  place  of  simple  dilution  investigations  ROESY-­‐NMR  and  DOSY-­‐NMR   experiments  were  performed.  Spectra  from  ROESY  experiments  with  3a  in  dry  CD2Cl2  at   3.4  mM  concentration  showed  a  small,  unexpected  NOE  between  protons  on  the   pendant  methoxyphenyl  group  and  the  proton  between  the  t-­‐butyl  and  ethynyl  groups   which  was  indicative  of  self-­‐association  in  solution  (Figure  9).  Examination  of  the  crystal   structure  of  3a  showed  the  closest  contacts  to  come  at  the  “elbows”  of  the  receptor,   where  intramolecular  NOE  could  mask  the  signal  arising  from  additional  intermolecular   contacts,  making  this  signal  the  only  clue  as  to  whether  or  not  3a  was  a  dimer  at  these   91     concentrations.  Further  ROESY  data  was  gathered  in  water-­‐saturated  solvent,  and  the   weak  intermolecular  NOE  was  no  longer  observable  (Appendix  C).           DOSY-­‐NMR  experiments  proved  much  more  enlightening  (Figure  10).  Correlation   of  the  relative  diffusivity  of  the  receptor  to  an  internal  standard  by  pulsed  field  gradient   NMR  spectrometry  allowed  the  molecular  mass  in  solution  to  be  calculated.12  Spectra   collected  on  2.3  mM  solutions  at  25  oC  of  3a  in  water  saturated  CDCl3  yielded  a  diffusion   coefficient  of  5.66  x  10-­‐5  cm2s-­‐1,  which  corresponds  to  a  molecular  mass  in  solution  of   722.06  ±  2.20  g/mol,  equivalent  to  the  molecular  mass  of  3a  within  0.31%  error  (relative   to  TMS).       Figure  10.  2D-­‐DOSY  spectrum  of  3a  showing  the  average  diffusion  coefficient  used  to   calculate  the  molecular  mass  relative  to  the  internal  standard  (TMS).       92     Protonation  by  introduction  of  a  slight  excess  of  TFA  to  the  same  DOSY  sample   from  above  resulted  in  a  diffusion  coefficient  of  5.23  x  10-­‐5  cm2s-­‐1,  equivalent  to  a   molecular  mass  in  solution  of  895.40  ±  62.06  g/mol,  quite  close  to  the  mass  of  3a·∙TFA   (833.34  g/mol).   These  data  were  corroborated  by  ESI-­‐MS  experiments  on  dilute  solutions  of   3a·∙TFA  in  hexanes.  Even  in  the  gas-­‐phase,  very  little  dimerization  is  evident  from  the   spectra,  although  a  mass  peak  which  could  be  attributed  to  a  singly  charged  dimer  is   present  at  low  abundance.       Figure  11.  ESI-­‐MS  spectrum  of  3a·∙TFA  from  hexanes  (neg,  M-­‐:  718.44,  C45H45N5O4:   719.87  g/mol).  See  Appendix  C  for  positive  mode  spectrum.     93     Nitrophenylurea  3b.  The  nitro-­‐substituted  receptor  3b  was  subjected  to  the   same  analysis  in  order  to  compare  its  solution-­‐state  aggregation  behavior  to  3a.  As  in   the  methoxyurea  receptor  3a,  dilution  experiments  seemed  to  indicate  monomer  in   solution,  as  no  significant  shifting  of  1H-­‐NMR  peaks  was  observed.    ROESY  spectra  of  3b   exhibited  only  NOE  cross  peaks  that  could  be  attributed  to  intramolecular  interactions  in   the  neutral  form  (Appendix  C).     Solid-­‐state  evidence  of  monomeric  3b  supported  the  solution  data.  Crystals  of  3b   grown  from  MeOH/DMSO  were  found  in  the  single  “U”  shape  found  for  protonated  3a,   cocrystallized  with  one  solvent  molecule  of  each  type  sharing  the  cavity  (Figure  12,   Appendix  C).         Figure  12.  ORTEP  representations  of  3b  (thermal  ellipsoids  at  50%  probability  level,  t-­‐ butyl  groups  and  solvent  removed  for  clarity).  Crystal  data  can  be  found  in  Appendix  C.     In  addition,  DOSY  spectra  of  3b  in  CDCl3  clearly  indicated  monomeric  3b  in   solution  as  the  freebase.  The  diffusion  coefficient  for  this  receptor  was  5.23  x  10-­‐5  cm2s-­‐1   94     which  produces  a  molecular  mass  in  solution  of  810.44  ±  60.63  g/mol,  equivalent  to  the   monomer  in  solution  within  error  (Appendix  C).     Protonation  of  this  receptor  with  TFA  in  CDCl3  yielded  DOSY  spectra  that  were   broad  and  contained  multiple  species  within  single  peaks.  The  mean  diffusion  coefficient   under  these  conditions  could  not  be  calculated  with  any  confidence,  but  does  indicate   complex  speciation  in  solution.       Figure  13.  Representative  2D-­‐DOSY  spectrum  of  3b·∙TFA  in  CDCl3  illustrating  the  broad,   ill-­‐defined  diffusion  coefficients  and  speciation  in  solution.     During  initial  anion  binding  studies,  1H-­‐NMR  titration  data  for  this  receptor  had   also  proven  difficult  due  to  a  broadening  of  the  signals  in  the  middle  of  the  titration,   which  we  attributed  to  aggregation  in  solution  (Appendix  C).  Additionally,  ESI-­‐MS   95     spectra  of  the  protonated  receptor  in  dilute  hexanes  seemed  to  indicate  dimeric  3b  is   present,  although  the  mass  peak  at  1479.39  m/z  did  not  match  the  expected  dimer  mass   of  1498.59  m/z.  However,  this  peak  position  and  its  isotopic  pattern  do  correspond  to   2[3b]·∙Cl-­‐,  a  dimer  around  Cl-­‐  that  displaced  the  TFA-­‐  counterion.         Figure  14.  ESI-­‐MS  spectrum  of  3b·∙TFA  from  hexanes  (M-­‐,  748.52,  C43H39N7O6:  749.81   g/mol;  M·∙TFA-­‐:  862.42,  C45H39N7O8F3:  862.83  g/mol;  M2·∙Cl-­‐,  1533.19,  C86H78N14O12Cl:   1533.56  g/mol).         Summary.  From  the  above  data  it  is  apparent  that  3a  weakly  self-­‐associates  in  solution   above  low  millimolar  concentration.  On  the  other  hand,  3b  exists  solely  as  a  monomer   in  solution  and  the  solid  state.  Protonation  of  3a  does  not  drastically  alter  the  behavior   of  this  compound  in  solution  and  the  data  for  3a·∙TFA  corroborate  the  solid-­‐state   96     evidence  of  monomeric  species  forming.  Although  there  is  extremely  weak  association   in  the  absence  of  competing  guests,  mass  spectroscopy  evidence  suggests  this  is  a   disfavored  occurrence.  For  electron-­‐withdrawn  3b,  however,  protonation  with  TFA   indicates  ground-­‐state  association  of  this  receptor  in  solution.  Water  saturated  solvents   were  used  for  these  experiments  in  order  to  both  standardize  the  conditions  for  each   measurement  and  to  more  closely  mimic  the  intended  aqueous  or  protic  environments   found  in  relevant  applications.       3a   3b   3a·∙TFA   3b·∙TFA   Crystal  data   Y   N   N   N/A   NMR  data   Y   N   N   Y   Mass  spec  data   Y   N   Y  (weak)   Y     Table  2.  Evidence  of  self-­‐association  (“Y”)  or  no  evidence  of  self-­‐association  (“N”)  in   urea  3a  and  3b.         Fluorescence  Experiments.  Knowing  the  ground-­‐state  association  of  receptors  3a  and   3b  allowed  us  to  elucidate  the  mechanism  of  the  fluorescence  in  both  systems.  The   majority  of  these  experiments  focused  on  the  origins  of  the  “OFF-­‐ON”  response  of  3b,  as   this  result  was  the  most  surprising.  This  section  will  therefore  focus  on  our  efforts  to   understand  the  underlying  principles  governing  the  response  of  this  receptor.     Methoxyphenylurea  3a.  The  fluorescence  behavior  of  3a  was  expected  due  to   the  observance  of  this  “OFF-­‐ON”  phenomenon  by  a  multitude  of  research  groups,   although  a  true  mechanism  for  the  quenching  of  monomeric  arylethynyl  pyridines  has   yet  to  be  postulated  in  the  literature.     97       Figure  15.  Fluorescence  emission  of  3a  (16.9  µM,  CHCl3)  as  the  freebase,  in  the  presence   of  1  equiv  of  TFA-­‐protonated  3a,  and  1  equivalent  of  N-­‐methylpyridinium   tetrafluoroborate.         Figure  15  illustrates  this  phenomenon  in  our  system.  Freebase  3a  in  CHCl3   fluoresced  normally.  Upon  the  addition  of  1  equivalent  of  a  concentrated  solution  of   3a·∙TFA  such  that  the  overall  concentration  of  3a  remained  constant,  the  emission  was   drastically  quenched.  Repeating  this  experiment  with  a  concentrated  solution  of  N-­‐ methylpyridinium  tetrafluoroborate  with  a  slight  excess  of  triethylamine  resulted  in  the   same  quenching,  indicating  the  excited  state  electron  transfer  to  pyridinium  and   subsequent  quenching  of  fluorescence  is  unrelated  to  the  protonation  state  of  the   pyridine  in  3a.  These  data,  in  tandem  with  the  aforementioned  calculations  and  the   literature  precedent,  served  to  convince  us  of  the  relatively  simple  fluorescence   behavior  of  this  receptor.     98         Nitrophenylurea  3b.  Due  to  the  non-­‐emissive  behavior  of  neutral  3b  which  can   be  understood  through  examination  of  the  FMO  maps  presented  above,  this  section  will   focus  on  3b·∙TFA  and  its  fluorescent  responses.       The  evidence  of  self-­‐association  in  solutions  of  3b·∙TFA  and  the  featureless,   bathochromically  shifted  emission  both  point  toward  excimer  emission.  If  ground-­‐state   association  was  giving  rise  to  this  excimer-­‐like  emission,  then  destabilization  of  the   complex  should  disfavor  emission  and  decrease  the  intensity.  To  probe  this,  a  solution   of  3b·∙TFA  in  CHCl3  was  systematically  solvent  switched  to  MeCN  while  maintaining  a   constant  receptor  concentration.       Figure  16.  UV-­‐Vis  absorbance  spectra  for  the  switching  of  3b·∙TFA  in  100%  CHCl3  to  0%   CHCl3  in  MeCN  at  7.1  µM.     99         While  the  charge  transfer  band  attributable  to  the  formation  of  the  pyridinium-­‐ trifluoroacetate  salt  is  still  apparent,  the  shape  of  the  overlapping  π-­‐π*  and  n-­‐π*   absorbance  bands  changes  slightly  from  CHCl3  to  MeCN  (Figure  16).  This  separation  of   the  bands  by  hypsochromically  shifting  the  n-­‐π*  absorbance  is  characteristic  of  a   decrease  in  electronic  density  on  the  pyridine  nitrogen.  This  decrease  coupled  with  the   intensification  of  the  charge  transfer  band  absorbance  at  405  nm  is  indicative  of  a  closer   contact  ion  pair  in  MeCN  than  CHCl3,  which  could  be  attributed  to  greater  localization  of   the  charge  upon  disruption  of  the  aggregated  receptor  when  switching  from  CHCl3  to   MeCN.       Figure  17.  Fluroescence  emission  spectra  of  the  7.1  µM  solutions  of  3b·∙TFA  from  Figure   16  upon  solvent  switching  from  100%  CHCl3  to  0%  CHCl3  in  MeCN.     100         Upon  increasing  the  MeCN/CHCl3  ratio  of  the  samples,  the  fluorescence  emission   is  drastically  reduced  and  red-­‐shifted  (Figure  17).  In  fact,  by  30%  CHCl3  in  MeCN  the   emission  is  equivalent  to  the  unprotonated  receptor  in  100%  CHCl3  solution.  From  these   data  it  can  be  concluded  that  3b·∙TFA  radiatively  decays  only  through  excimer  interaction   with  other  receptor  molecules  in  solution,  which  is  supported  by  the  bathochromic  shift   in  the  emission  as  de-­‐excitation  is  in  competition  with  dissociation  of  the  complex  in   polar  media.   Fluorescence  lifetimes.  An  additional  piece  of  evidence  for  excimer  formation   can  be  found  in  excited  state  lifetime  measurements.  Excimeric  fluorescence  in  solution   is  restricted  to  short  lifetimes,  as  it  is  in  competition  with  relaxation  by  non-­‐radiative   intersystem  crossing  which  typically  occurs  on  the  order  of  10-­‐7  to  10-­‐9  seconds.  This  is   usually  observed  as  a  polyexponential  decay  due  to  concomitant  fluorescence  emission   from  both  monomeric  and  excimeric  species.13       Time-­‐correlated  single  photon  counting  spectroscopy  allows  for  the  measurement  of   changes  in  fluorescence  emission  down  to  picoseconds  time  frames  without  the  need   for  reference  compounds.  Solutions  of  3f,  3f·∙HCl  and  3b·∙HCl  at  8µM  were  measured   using  a  360  nm  laser  diode  light  source  in  CHCl3  versus  a  scattering  solution  of  15  µM   Ludox  (Figures  18  and  19).  Receptor  3f  was  chosen  for  comparison  due  to  its  strong   emission  at  both  the  longer  and  shorter  wavelengths  observed  thus  far  (Figure  7),  and   HCl  was  chosen  as  the  proton  source  due  to  the  increased  fluorescence  versus   protonation  with  TFA.     101             Figure  18.  TCSPC  fitting  of  decay  data  for  (a)  3f  in  CHCl3  and  (b)  3f·∙HCl  at  8µM  (chi2  <  2).   The  biexponential  decay  (green  line)  was  fit  relative  to  instrument  response  (blue   scatter  plot).  Residuals  are  plotted  at  bottom  of  each.   a   b   102         Figure  19.  TCSPC  fitting  of  decay  data  for  3b·∙HCl  in  CHCl3  at  8µM  (chi2  >  2).  The   biexponential  decay  (green  line)  was  fit  relative  to  instrument  response  (blue  scatter   plot).  Residuals  are  plotted  at  bottom.     From  the  slope  of  the  fitted  curves  in  Figures  19  and  20  it  is  apparent  that   protonation  of  3f  significantly  shortens  the  lifetime  of  the  excited  state  (Table  3).         3f   3f·∙HCl   3b·∙HCl   Lifetime  1  (ns,  ratio)   1.065  ns  (82%)   0.121  ns  (93%)   0.952  ns  (68%)   Lifetime  2    (ns,  ratio)   1.707  ns  (18%)   0.693  ns  (3%)   1.218  ns  (32%)     Table  3.  Biexponential  fitting  data  for  3f,  3f·∙HCl  and  3b·∙HCl.  The  ratios  of  each  lifetime   are  representative  of  the  relative  percent  of  the  population  of  fluorescing  species  in   solution.         The  lifetime  data  are  strong  evidence  of  an  excimeric  mechanism  for  the  OFF-­‐ON   fluorescence  response  observed  in  these  compounds.  In  all  cases  the  biexponential  fit   103     can  be  correlated  to  the  most  intense  fluorescence  band  as  well  as  the  residual  emission   band  observed  in  these  solutions,  and  the  relative  ratio  of  each  correlates  well  with  the   relative  intensity  observed.  The  lifetimes  observed  for  3f  are  not  quite  long  enough  that   an  excimeric  mechanism  can  be  ruled  out  in  the  neutral  state,  but  the  protonated   species  in  both  cases  definitively  exhibit  the  short  lifetimes  characteristic  of  excimeric   fluorescence.     Conclusion       In  conclusion,  we  have  disclosed  the  development  of  a  receptor  scaffold  with   switchable  “ON-­‐OFF”  or  “OFF-­‐ON”  fluorescence  based  upon  judicious  choice  of  the   pendant  phenyl  functionalities.  While  the  behavior  of  ON-­‐OFF  responsive  receptors  was   not  surprising,  the  origins  of  the  OFF-­‐ON  response  of  3b  and  its  analogs  required   comparison  of  fluorescent  lifetimes,  self-­‐association  and  stability  data  in  order  to   determine  the  origins  of  this  behavior.  Remarkably,  these  results  indicate  that  this  class   of  receptors  can  function  as  a  positive  response  (OFF-­‐ON)  fluorescent  indicator  for   chloride  ion,  although  it  seems  to  be  limited  to  applications  in  nonpolar  media.   Additionally,  the  occurrence  of  both  a  colorimetric  and  switchable  fluorescent  ON-­‐OFF   or  OFF-­‐ON  response  in  a  single  class  of  compounds  is  promising  for  application  in   molecular  logic  systems,  where  they  could  conceivably  function  as  complex  gates,  e.g.,   INHIBIT  or  enabled  OR  operators.  Our  mechanistic  understanding  of  the  process   governing  the  positive  OFF-­‐ON  response  of  these  receptors  should  allow  for  the  rational   104     design  of  improved  receptors  capable  of  exhibiting  this  response  in  competitive  media   for  a  variety  of  anionic  targets.     Experimental       General  Details.  1H  and  13C  NMR  spectra  were  obtained  on  a  Varian  300  MHz   spectrometer  (  1H  299.95  Hz,  13C  75.43  Hz)  or  Inova  500  MHz  spectrometer  (1H  500.10   MHz,  13C  125.75  MHz)  or  Varian  Inova  600  (1H  599.98  MHz,  13C  150.86  MHz)   spectrometer.  Chemical  shifts  (∂)  are  expressed  in  ppm  downfield  from   tetramethylsilane  (TMS)  using  non-­‐deuterated  solvent  present  in  the  bulk  deuterated   solvent  (CDCl3:  1H  7.26  ppm,  13C  77.0  ppm;  CD2Cl2:  1H  5.32  ppm  13C  54.0  ppm).  Unless   otherwise  specified,  solvents  were  obtained  from  distillation  using  published  literature   procedures  directly  before  use.     Mass  spectra  were  acquired  on  a  Thermo  Finnigan  LCQ  Deca  XP  Plus  electrospray   ionization  spectrometer  in  positive  mode  in  MeOH  solvent.       UV-­‐Vis  spectra  were  acquired  with  a  Hewlett-­‐Packard  8453  UV-­‐Visible   spectrophotometer  equipped  with  a  250  nm  cutoff  filter.       Fluorescence  data  was  acquired  with  a  Horiba  Jobin-­‐Yvon  FluoroMax-­‐4   fluorescence  spectrophotometer  equipped  with  an  integrating  sphere.  All  spectra   were  uncorrected  for  lamp  response  unless  otherwise  specified.  Absolute   photoluminescence  quantum  yields  were  taken  in  O2-­‐  containing  (no  inert  gas   purging)  CHCl3.  All  slit  widths  (ex/em)  were  held  constant  at  5  nm/5  nm,  and       105     quantifiable  data  was  obtained  by  correction  of  the  spectra  to  lamp  response  and   integrating  sphere  reflectivity.       Experimental  conditions  for  fluorescence  measurements,  excitation  spectra,   supporting  mass  spectral  and  1H-­‐NMR  data  can  be  found  in  Appendix  C.         Methoxyphenyl  urea  3a.  Dianiline  1  (100  mg,  0.238  mmol)  was  reacted  in  a   flame  dried,  15  ml  round-­‐bottomed  flask  with  p-­‐methoxyphenyl  isocyanate  (88.6  mg,   0.594  mmol)  in  5  mL  freshly  distilled  toluene.  The  crude  reaction  was  diluted  with   pentane,  filtered  through  a  sintered  glass  funnel  and  the  crude  solid  collected.   Trituration  with  chloroform  yields  3a  as  an  off-­‐white  solid  (160  mg,  93.4%).   Recrystallization  by  diffusion  (pentane/chloroform)  yields  colorless  crystals.  Mp:  178-­‐ 180  oC.  1H  NMR  (300  MHz,  DMSO-­‐d6):  ∂  9.37  (br  s,  2H),  8.32  (br  s,  2H),  8.12  (d,  J  =  9  Hz,   2H),  8.10  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.91  (d,  J  =  7.8  Hz,  2  H),  7.63  (d,  J  =  2.1  Hz,  2H),  7.57  (dd,  J  =   6.3,  2.1  Hz,  2H),  7.47  (d,  J  =  8.7  Hz,  4H),  6.97  (d,  J  =  8.7  Hz,  4H),  3.82  (s,  6H),  1.40  (s,  18   H).  13C  NMR  (300  MHz,  DMSO-­‐d6):  ∂  151.08,  148.83,  140.99,  139.29,  134.93,  133.90,   128.88,  125.49,  124.07.  123.73,  116.63,  116.35,  110.51,  106.44,  89.93,  82.33,  51.61,   30.41,  27.43.  MS  (ESI  pos)  m/z  (%):  744.8  (M+Na+  +2,  10)  743.8  (M+Na+  +1,  40),  742.7   (M+Na+,  100),  741.1  (10),  740.1  (8);  C45H45N5O4  (719.35),  C45H45N5O4Na  (742.34).   Nitrophenyl  urea  3b.  Dianiline  1  (100  mg,  0.238  mmol)  was  reacted  in  a  flame   dried,  15  ml  round-­‐bottomed  flask  with  p-­‐nitrophenyl  isocyanate  (97.5  mg,  0.594  mmol)   in  5  mL  freshly  distilled  toluene.  The  crude  reaction  was  diluted  with  pentane,  filtered   through  a  sintered  glass  funnel  and  the  crude  solid  collected.  Trituration  with   chloroform  yields  3b  as  a  pale  yellow  solid  (166  mg,  93%).  Recrystallization  by  diffusion   106     (pentane/chloroform)  yields  pale  yellow  crystals.  Mp:  186  oC  –  decomp.  1H  NMR  (300   MHz,  DMSO-­‐d6):  ∂  10.13  (br  s,  2H),  8.54  (br  s,  2H),  8.19  (d,  J  =  9  Hz,  4H),  8.02-­‐7.98  (m,   3H),  7.82  (d,  J  =  7.8  Hz,  2H),  7.71  (d,  J  =  9  Hz,  4H),  7.57  (d,  J  =  2.1  Hz,  2H),  7.51  (dd,  J  =   6.6,  2.1  Hz,  2H),  1.30  (s,  18  Hz).  13C  NMR  (300  MHz,  DMSO-­‐d6):  ∂  152.49,  146.81,  146.28,   143.45,  141.85,  138.22,  129.94,  128.44,  128.12,  125.92,  121.19,  118.26,  111.68,  94.27,   86.40,  34.77,  31.64.  MS  (ESI  pos)  m/z  (%):  776.6  (M+Na+  +5,  9),  775.6  (M+Na+  +4,  14),   774.9  (M+Na+  +3,  31),  774  (M+Na+  +2,  65),  773.2  (M+Na+  +1,  98),  772.4  (M+Na+,  100);   C43H39N7O6  (749.81),  C43H39N7O6Na  (772.8).   Methoxyphenyl  sulfonamide  4a.  Dianiline  1  (110  mg,  0.26  mmol)  was  reacted  in   a  flame-­‐dried  15  mL  round-­‐bottomed  flask  with  p-­‐methoxybenzenesulfonyl  chloride   (268  mg,  1.3  mmol)  in  freshly  distilled  pyridine  under  inert  atmosphere  (N2).  Following   concentration  in  vacuo,  the  crude  product  was  filtered  through  a  2.5  cm  silica  plug  with   100%  EtOAc.  Purification  by  chromatography  (20:1  CH2Cl2:EtOAc)  afforded  4a  (185  mg,   93%)  as  a  white  crystalline  solid.  Recrystallization  by  diffusion  (hexanes:CH2Cl2)  afforded   colorless  crystals.  Mp:  141-­‐143  oC.  1H  NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  7.77  (d,  J  =  9  Hz,  4H),   7.72  (t,  J  =  7.7  Hz,  1H),  7.54-­‐7.44  (m,  8H),  7.33  (dd,  J  =  9.2,  2.4  Hz,  2H),  6.81  (d,  J  =  9  Hz,   4H),  3.72  (s,  6H),  1.24  (s,  18H).  13C  NMR  (75  MHz,  CDCl3):  ∂  163.06,  147.62,  142.93,   136.75,  135.70,  130.85,  129.60,  129.43,  127.85,  126.44,  120.64,  114.09,  113.02,  93.28,   85.33,  55.45,  34.31,  31.03.  MS  (ESI  pos)  m/z  (%):  765.5  (6),  764.5  (18),  763.5  (36),  762.6   (MH+,  100);  C43H43N3O6S2  (761.95);  786.3  (M+Na+  +2,  4),  785.3  (M+Na+  +1,  9),  784.33   (M+Na+,  20);  C43H43N3O6S2Na  (784.85).   107     Nitrophenyl  sulfonamide  4b.  Dianiline  1  (150  mg,  0.36  mmol)  was  reacted  in  a   flame-­‐dried  15mL  round-­‐bottomed  flask  with  p-­‐nitrobenzenesulfonyl  chloride  (180  mg,   0.81  mmol)  in  freshly  distilled  pyridine  under  inert  atmosphere  (N2).  Following   concentration  in  vacuo,  the  crude  product  was  filtered  through  a  2.5  cm  silica  plug  with   100%  EtOAc.  Purification  by  chromatography  (20:1  CH2Cl2:EtOAc)  afforded  4b  (265  mg,   93%)  as  a  yellow  solid.  Recrystallization  by  diffusion  (hexanes:CH2Cl2)  afforded  pale   yellow  crystals.  Mp:  136-­‐139  oC.  1H  NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.15  (d,  J  =  8.7  Hz,  4H),   8.03  (d,  J  =  8.7  Hz,  4H),  7.74  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.55  (d,  J  =  8.7  Hz,  2H),  7.48-­‐7.38  (m,  6H),   1.29  (s,  18H).  13C  NMR  (75  MHz,  CDCl3):  ∂  150.10,  149.33,  145.32,  142.68,  137.20,   134.63,  129.82,  128.68,  128.28,  126.31,  124.12,  123.31,  114.59,  92.68,  85.71,  34.51,   31.05  MS  (ESI  pos)  m/z  (%):  795.5  (M+  +3,  6)  794.5  (M+  +2,  16),  793.5  (MH+,  33),  792.5   (M+,  59),  608  (18),  607  (46);  C41H37N5O8S2  (791.89);  817.2  (MNa+  +3,  6),  816.2  (MNa+  +2,   20),  815.2  (M+Na+  +1,  39),  814.2  (M+Na+,  100);  C41H37N5O8S2Na  (814.88).       Methylester-­‐phenyl  urea  3e.  To  a  flame-­‐dried  50  mL  three-­‐neck  round-­‐ bottomed  flask  equipped  with  a  stir  bar  and  N2  inlet  was  added  25  mL  toluene,  3   (100  mg,  0.237  mmol)  and  p-­‐isocyanato-­‐methylbenzoate  (88  mg,  0.498  mmol).  The   reaction  was  allowed  to  stir  for  3  h,  whereupon  it  was  concentrated  in  vacuo  and   purified  by  column  chromatography  (50%  EtOAc/hexanes,  5%  TEA)  to  yield  3e  (129   mg,  70.1%)  as  a  yellow  amorphous  solid.  This  was  taken  up  in  methylene  chloride   and  protonated  with  trifluoroacetic  acid.  Precipitation  with  pentane  yielded  yellow   orange  solid  suitable  for  1H-­‐NMR.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.57  (br  s,  2H),  8.33       108     (t,  8.1  Hz,  1H),  8.05  (br  s,  2H),  7.91  (m,  6H),  7.62-­‐7.57  (m,  4H),  7.52  (d,  8.7  Hz,  4H),   3.90  (s,  6H),  1.34  (s,  18H).         Butylphenyl  urea  3f.  To  a  flame-­‐dried  50  mL  three-­‐neck  round-­‐bottomed   flask  equipped  with  a  stir  bar,  reflux  condensor  and  N2  inlet  was  added  25  mL   toluene,  3  (250  mg,  0.594  mmol)  and  butyl  isocyanate  (235,  2.38  mmol).  The   reaction  was  heated  to  100  oC  for  12  h.  Upon  completion  the  solution  was   concentrated  in  vacuo  and  purified  by  column  chromatography  (50%  EtOAc/hexanes)   to  yield  3f  as  a  white  amorphous  solid  upon  standing.  (265  mg,  58%).  1H-­‐NMR  (600   MHz,  CDCl3):  δ  7.76  (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  7.61  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.48  (dd,  2.4,  8.4  Hz,   2H),  7.38  (d,  7.2  Hz,  2H),  7.27-­‐7.26  (obscured  d,  2H),  6.89  (br  s,  4H),  3.23  (t,  J  =  7.2   Hz,  4H),  1.45  (J  =7.2  Hz,  4H),  1.35-­‐1.26  (m,  22H),  0.82  (t,  7.2  Hz,  6H).  13C-­‐NMR  (600   MHz,  CDCl3):  δ  155.64,  152.31,  143.37,  136.44,  131.03,  122.31,  109.99,  92.74,  85.33,   40.27,  34.84,  31.78,  31.16,  31.09,  20.00,  13.70.     Bridge  to  Chapter  V       Chapter  IV  focused  on  the  switchable  fluorescence    observed  upon   protonation  of  electron-­‐rich  and  electron-­‐poor  urea  and  sulfonamide-­‐functionalized   arylethynylpyridines.  The  mechanisms  dictating  the  fluorescent  responses  of  the   urea  receptors  were  found  to  be  defined  by  both  monomolecular  and  bimolecular   events.  In  tandem  with  our  knowledge  of  the  binding  preferences  of  the  urea   receptors,  these  data  serve  as  a  logical  bridge  to  extend  our  understanding  of  anion-­‐     109     mediated  self-­‐assembly  processes  and  to  develop  functional  probes  for  specific   anions  in  biological  media.       Chapter  V  will  focus  on  two  major  classes  of  preliminary  results:  development   of  these  probes  for  in  vitro  imaging  applications  and  the  study  of  the  anion-­‐mediated   self-­‐assembly  of  these  receptors.  The  data  presented  in  this  chapter  are  unfinished,   but  are  included  to  give  an  applications  context  to  the  mechanistic  results  presented   thus  far  and  to  summarize  the  current  state  of  these  ongoing  projects.  The  future   directions  in  which  this  research  is  proceeding  will  also  be  presented.       110       CHAPTER  V     FUNCTIONALIZED  ANILINOETHYNYLPYRIDINE  UREAS:  IN  VITRO  IMAGING  AND  ANION   MEDIATED  SELF-­‐ASSEMBLY     Introduction       This  chapter  was  coauthored  with  Dr.  John  J.  Naleway  of  Marker  Gene   Technologies,  who  provided  the  epifluorescence  images;  and  Matthew  Carnes,  who   designed  the  circular  dichroism  experiments  and  synthesized  compound  4.  The  data   presented  in  this  chapter  are  unfinished  and  should  serve  to  give  the  reader  an   understanding  of  the  current  state  of  the  project  and  the  direction  in  which  it  will   proceed  in  the  near  future.  It  is  presented  in  two  parts:  cellular  assays  with  1a·∙TFA  and   current  supporting  experiments;  and  anion-­‐mediated  assemblies  of  other  urea-­‐ functionalized  receptors  and  current  supporting  experiments.         As  the  natural  ubiquity  of  ionophores  and  the  importance  of  the  roles  they  play   in  the  regulation  of  biological  function  have  been  realized  chemists  have  increasingly   turned  their  attention  to  understanding  the  structure-­‐function  relationships  of  these   compounds.1  Since  many  commonly  occurring  ionophores  in  biological  systems  are   involved  in  transmembrane  transport  or  cell  signaling  pathways,  much  of  the  focus  has   been  on  the  study  of  single  ion  or  ion-­‐pair  channels  and  cell  signaling  in  these  domains.       Chloride  and  nitrate  are  commonly  occurring  and  eminently  important  anions  in   biological  systems.  Dysfunction  in  cAMP-­‐regulated  Cl-­‐  ion  channels,  in  particular  cystic   111     fibrosis  transmembrane  conductance  regulatory  protein  (CFTR)  leads  to  ion   misregulation  in  the  epithelial  cell  lining  and  results  in  cystic  fibrosis.1b,2  The  choroid   plexus  inward  rectifying  channel,  which  regulates  the  blood-­‐cerebrospinal  fluid  ion   gradient,  supports  the  neuronal  signal  cascade  via  a  K+/Na+/Cl-­‐  co-­‐transport   mechanism.3  Chloride  ion  channels  (ClC)  1  and  5,  regulate  ion  gradients  across  many   cellular  membranes,  where  dysfunction  results  in  myotonia  congenita  and  renal  failure.4     Nitrate,  on  the  other  hand,  was  first  implicated  in  gastric  cancer  via  metabolism   to  nitric  oxide  and  nitrosylation  of  DNA.5  In  contrast  to  this,  in  2009  it  was  hypothesized   that  dietary  NO3-­‐  may  serve  as  the  sole  regulator  of  NO/nitroso  homeostasis  in   individuals  with  inhibited  nitric  oxide  synthase  function,  i.e.,  diabetics.6  Current  research   on  the  exact  role  of  nitrate  in  biological  systems  demands  effective,  highly  selective  and   highly  resolved  probes  for  this  ion  in  cellular  matrices.   For  these  investigations  it  is  of  paramount  importance  that  the  chemical  species   involved  be  monitored  in  a  quantifiable  manner  with  high  temporal  and  spatial   resolution.7  Under  these  limiting  circumstances,  typical  cell  imaging  technologies  can  fall   short.  Incorporation  of  the  commonly  used  fluorescent  proteins  requires  ground-­‐up   expression  through  gene  manipulation,  which  tends  to  limit  the  spatial  resolution   achievable  and  inevitably  leads  to  slower  response  times.8  Probe  size  can  also  be   detrimental,  as  large  non-­‐natural  perturbations  to  the  system  can  affect  the  natural   function  of  the  pathway  or  channel  under  study.9         112       A.  Cellular  Imaging  of  Inorganic  Anions   Selective,  highly  responsive  small  molecule  fluorescent  indicators  are  promising   entities  for  use  in  systems  where  the  typical  fluorescent  proteins  and  their  analogs  may   be  insufficient.  Quantitative  and  localizable  small  molecule  probes  have  been  developed   for  biologically  relevant  inorganic  cations,  although  only  a  few  examples  exists  for   imaging  their  anionic  counterparts  in  vitro.10  These  anion-­‐sensors  are  invariably  “ON-­‐ OFF”  responsive,  thus  demonstrating  a  need  for  “OFF-­‐ON”  responsive  indicators  for  in   vitro  measurement  of  biologically    occurring  inorganic  anions.     We  focused  our  attention  on  the  fluorescent  signaling  of  Cl-­‐  in  vitro  by  our   receptors,  due  to  the  Cl-­‐  binding  ability  observed  in  the  parent  phenylurea  receptor.  In   collaboration  with  Marker  Gene  Technologies,  we  screened  urea  and  sulfonamide   receptor  candidates  in  both  the  neutral  and  trifluoroacetic  acid-­‐protonated  states.       Figure  1.  Receptors  used  in  cellular  assays.     113               Figure  2.  (Top  Left)  Epifluorescence  image  of  NIH3t3  mouse  embryo  fibroblasts   incubated  with  a  7.4  pH  buffered,  high  Cl-­‐  solution  and  stained  with  1a·∙TFA  at  50µM;   (top  right)  Nomarski  phase  contrast  image  of  same;  (bottom)  Epifluorescence  image  of   above,  incubated  in  Cl-­‐  free  buffer  system  isotonically  balanced  by  NO3-­‐  (Appendix  D).           The  epifluorescence  assays  were  carried  out  according  to  literature  precedent.10b     NIH3T3  embryonic  mouse  fibroblasts  were  grown  in  a  humidified  atmosphere  and   transferred  to  22mm  circular  sterile  glass  coverslips  in  12-­‐well  plates  for  staining.  The   cover  slips  were  rinsed  and  incubated  for  20  minutes  with  a  saline  solution  (120  mM   KCl,  20  mM  NaCl,  1  mM  MgCl2,  1mM  CaCl2,  10mM  HEPES  pH  buffer  at  pH  7.4),   114     containing  high  concentration  Cl-­‐  ion.  For  the  controls,  the  saline  solution  was  isotonic   with  NO3-­‐  instead  of  Cl-­‐  (120  mM  KNO3,  20  mM  NaNO3,  1  mM  MgCl2,  1mM  CaCl2,  10mM   HEPES  pH  buffer  at  pH  7.4)  to  afford  the  low  Cl-­‐  media.  The  receptor  was  dissolved  in   DMSO  and  introduced  to  the  well  plates  such  that  the  DMSO:H2O  ratio  was  10%,  and   the  final  receptor  concentration  was  50  µM.  This  was  allowed  to  stand  for  45  minutes,   and  then  rinsed  thrice  with  the  saline  solution  used  previously.   Unexpectedly,  our  initial  assays  were  successful  only  with  1a·∙TFA.  We   corroborated  these  results  by  repetition  of  the  above  assays  at  multiple  concentrations   of  receptor,  and  by  increasing  the  receptor  staining  time  to  one  hour  (Figure  3).       [1a·∙TFA]   High  Cl-­‐,  1  hr   Low  Cl-­‐,  1  hour   50  µM             100  µM             Control             Table  1.  Summary  of  epifluorescence  results.  The  left  hand  column  in  each  set  is  the   Nomarski  phase  contrast  image,  the  right  hand  is  epifluorescence  (ex:  450-­‐495  nm,  515   nm  emission  cutoff  filter).  The  controls  at  bottom  are  10%  DMSO  only  (no  1a·∙TFA),  with   and  without  cells  (left  and  right,  respectively).  See  Appendix  D  for  further  details.   115             Figure  3.  (Left)  Nomarski  phase  contrast  image  of  1a,  subjected  to  the  same  conditions   as  above;  (right)  epifluorescence  image  of  same.     From  inspection  of  the  epifluorescence  results  in  Table  1  it  became  apparent   that  the  receptor  is  localizing  in  the  lipid  portions  of  the  cells,  most  likely  due  to  its  low   solubility  in  water.  The  cells  themselves  exhibit  evidence  of  hypotonic  shock  from  the   multiple  washes  and  distorted  membranes,  most  likely  due  to  the  high  level  of  DMSO   used  to  add  the  receptor.   The  binding  constants  for  1a·∙TFA  for  both  chloride  and  nitrate  were  determined   by  UV-­‐Vis  titration  in  CHCl3.  In  spite  of  the  poor  match  in  solvents,  the  trend  for   fluorescence  response  is  conserved,  as  seen  in  Table  2.     TBAX   1aa   1a·∙TFA b   Cl -­‐   NO 3 -­‐   730  M -­‐1   280  M -­‐1   40,700  M -­‐1   12,100  M -­‐1    a  1H-­‐NMR  titration;  b  UV-­‐Vis  titration   Table  2.  Binding  constants  for  1a  and  1a·∙TFA  in  water  saturated  CHCl3  with   tetrabutylammonium  salts  of  chloride  and  nitrate  (Appendix  D).     116     Cell  viability  studies  and  staining  longevity  assays  indicate  that  1a·∙TFA  is  fairly   innocuous  and  that  the  receptor  complex  remains  highly  fluorescent  for  at  least  24   hours  (Table  3).  With  the  exception  of  the  entry  for  the  50  µM  receptor  under  high  Cl-­‐   conditions,  the  cells  are  no  less  viable  than  when  treated  with  10%  DMSO  by  itself.  The   8%  viability  for  50  µM  receptor  is  attributable  to  extremely  low  retention  of  cells  on  the   slides  being  examined,  a  problem  that  we  had  to  surmount  due  in  part  to  the  addition  of   DMSO  to  the  cellular  media  prior  to  final  washes  to  remove  excess  1a·∙TFA,  and  to  the   presence  of  semi-­‐amphiphilic  1a·∙TFA  acting  as  a  surfactant.     Stain  concentration   High  Cl-­‐   Low  Cl-­‐   50  uM   8%   95%   100  uM   86%   98%   DMSO   85%   100%     Table  3.  Cell  viability  upon  treatment  with  the  receptor  and  saline  solutions,  and  10%   DMSO.         As  reported  in  Chapter  IV,  electron-­‐rich  receptors  in  organic  media  exhibited  ON-­‐ OFF  responses,  whereas  electron-­‐poor  receptors  had  the  same  OFF-­‐ON  responses  as   those  seen  in  the  cellular  assays.  Critical  examination  of  both  of  these  results  led  to  the   realization  that  not  only  are  the  receptors  behaving  in  direct  opposition  to  what  was   observed  outside  of  cellular  media,  but  none  of  the  emission  bands  observed  in  any  of   the  receptor  classes  would  give  rise  to  the  intense  green  fluorescence  seen  in  cells.  The   ambiguity  of  both  the  results  and  the  media  in  which  we  were  seeing  the  occurrence  of   this  fluorescence  led  us  to  study  this  phenomenon  in  a  model  cellular  system.     117     Fluorescence  in  Vesicles.  Much  of  the  current  research  in  transmembrane  ion  transport   depends  upon  model  cellular  systems  consisting  of  simple  vesicles  formed  by   phospholipid  bilayers  in  aqueous  media.11  Using  these  liposomes  as  a  model  for  the  lipid   bilayer  of  cellular  membranes  in  our  system  was  a  logical  extension  of  the  cellular   studies  presented  in  the  previous  section  and  served  to  explain  the  unexpected   fluorescence  behavior.       Phospholipid  POPC  was  used  to  form  vesicles  which  contained  high  Cl-­‐  solution   (120  mM  KCl  and  1  mM  CaCl2)  and  low  Cl-­‐  solution  (120  mM  NaNO3  and  1  mM  CaCl2).   Both  vesicle  solutions  were  dialysed,  and  then  split  into  two  equal  volumes.  Of  these   aliquots,  one  was  diluted  with  the  same    low  Cl-­‐  containing  aqueous  external  solution   and  one  with  0  Cl-­‐  content  (120  mM  KNO3),  both  buffered  at  pH  7.2  (10  mM  HEPES).  This   resulted  in  four  vesicle  solutions:  high  internal  Cl-­‐  content  and  low  external  Cl-­‐  content   (A);  high  internal  Cl-­‐  content  and  no  external  Cl-­‐  (B);  low  internal  Cl-­‐  content  and  low   external  Cl-­‐  content  (C);  and  low  internal  Cl-­‐  content  and  no  external  Cl-­‐  (D).  Treatment   of  these  vesicle  solutions  with  1a·∙TFA  as  a  solution  in  10%  DMSO  analogous  to  the   cellular  assays  led  to  dual  emission  spectra  in  all  cases  (Figure  4).    Solutions  of  1b  and   1b·∙TFA  subjected  to  the  same  conditions  showed  no  evidence  of  fluroescence  emission.       118         Figure  4.  Fluorescence  emission  spectra  of  vesicle  solutions  containing  1a·∙TFA:  (top)   solution  A;  (bottom)  solution  C.  Bulk  lipid  concentration:  4.21  mM;  receptor   concentration:  2.78  µM.           Figure  4  summarizes  the  data  obtained  from  the  two  most  balanced  solutions,  A   and  C.  The  tonic  imbalance  in  solutions  B  and  D  resulted  in  irreproducible  results,  most   likely  from  autolysis  of  the  vesicles  due  to  the  Cl-­‐  gradient,  although  a  posteriori  review   119     of  the  literature  indicates  that  this  could  be  overcome  with  judicious  choice  of  balancing   ions  in  the  external  solution  during  preparation.12         The  emission  band  in  the  spectra  at  530  nm  equates  to  the  green  emission   observed  in  the  epifluorescence  assays,  and  is  indicative  of  the  Cl-­‐  concentration  as  can   be  seen  by  the  differences  in  intensities  between  the  two  solutions.  In  the  high  Cl-­‐  case   (solution  A)  it  can  be  seen  that  lysing  the  vesicles  with  the  surfactant   polyoxyethylene(8)lauryl  ether  not  only  diminishes  the  530  nm  emission  band,  but  that   emission  is  concurrently  recovered  in  the  430  nm  band.  In  fact,  this  recovery  is  observed   in  both  solutions  and  seems  to  be  indicative  of  the  overall  concentration  of  fluorophore   in  solution.  Data  from  heating  solutions  of  these  vesicles  to  dirupt  the  vesicle  also   results  in  quenching  of  the  530  nm  band,  the  same  as  seen  upon  lysing  the  vesicles.   These  data  support  the  hypothesis  that  there  exists  a  dependence  upon  complex   formation  or  aggregation  for  the  530  nm  emission  to  occur.  Additionally,  the  dual   emission  behavior  of  1a·∙TFA  augers  well  for  the  use  of  this  receptor  as  a  self-­‐consistent   ratioable  sensor  in  aqueous  media.       Aggregation  Induced  Emission  in  Aqueous  Media.  The  mechanism  for  the  fluorescence   emission  of  1a·∙TFA  is  unclear,  but  seemed  to  be  highly  dependent  upon  solvophobic   effects  and  localization  either  in  cellular  or  synthetic  lipid  membranes.  Supporting   experiments  in  aqueous  media  seemed  to  indicate  that  it  is  aggregation  induced,  which   would  explain  the  observed  localization  of  fluorescence  emission  in  lipid-­‐dense  areas  of   the  cells.    These  data  are  presented  herein.   120         Aggregation  induced  emission  (AIE)  arises  from  restricted  intermolecular   rotation  (RIR)  of  the  fluorophore,  which  has  the  effect  of  destabilizing  thermal   relaxation  and  increasing  the  emission  quantum  yield.13b  This  process  runs  counter  to   the  more  well  understood  process  of  concentration-­‐dependent  quenching  in   photoluminescent  systems.14  Additionally,  AIE  is  rarely  seen  in  aggregates  exhibiting   large  degrees  of  π-­‐π  stacking,  as  this  electronic  interaction  generally  leads  to  static   quenching  of  the  excited-­‐state  by  electron  transfer,  with  the  exception  of  fluorophores   exhibiting  excimer  or  exciplex  emission,  as  in  protonated  1b.15       The  fluorescence  behavior  observed  in  aqueous  solutions  of  Cl-­‐  containing   vesicles  and  1a·∙TFA  was  not  observed  for  1a·∙TFA  in  DMSO  solution  or  any  aqueous   solutions  of  1b·∙TFA.  If  aggregation  of  the  receptor  was  driving  fluorescence  in  1a·∙TFA   then  it  would  be  expected  that  a  “good”  solvent  for  the  receptor,  such  as  DMSO,  would   result  in  non-­‐fluorescent,  molecularly  dissolved  receptor  solutions.  In  order  to  verify   aggregation  induced  emission  in  this  receptor,  neutral  1a·∙TFA  was  taken  up  in  DMSO   and  the  resulting  solutions  slowly  switched  to  a  less  solubilizing  medium.  The  initial   1a·∙TFA/DMSO  solutions  were  orange  and  non-­‐fluorescent.  If  AIE  was  the  cause  of  the   observable  fluorescence  in  cell  assays  and  vesicle  experiments,  then  titration  of  water   into  the  DMSO  solutions  of  1a·∙TFA  such  that  the  receptor  became  poorly  solvated   would  lead  to  aggregation  and  fluorescence,  while  retaining  the  colorimetric  indication   of  protonation  (an  orange  hue).13     To  DMSO  solutions  of  1a·∙TFA  at  1.96  mM  was  added  HEPES  buffered  (pH  7.2)   aqueous  solutions  of  KNO3  or  KCl  such  that  the  final  solutions  reached  35  -­‐  40%  DMSO  in   121     H2O  (see  Appendix  D  for  supporting  experiments  with  deionized  water  and  LiClO4   solutions).           Figure  5.  Fluorescence  emission  data  for  aggregation  experiments.  (Top)  Titration  of   KNO3  in  buffered  water  into  DMSO  solution  of  1a·∙TFA;  (bottom)  titration  of  KCl  in   buffered  water  into  DMSO  solution  of  1a·∙TFA.     122     The  results  summarized  in  Figure  5  indicate  that  solution-­‐phase  aggregation  is   the  source  of  the  430  nm  fluorescence  emission  band.  Repeating  these  experiments   with  pure  water  or  LiClO4  yielded  approximately  equivalent  spectra,  although  plain   water  did  not  induce  aggregation  until  the  solution  reached  33%  DMSO  in  H2O   (Appendix  D).  Of  note  in  the  KCl  spectra  (Figure  5,  bottom)  is  the  absence  of  the  530  nm   emission  band  seen  in  the  vesicle  solutions  in  the  presence  of  Cl-­‐.  The  absence  of  this   band  could  be  attributable  to  the  substantial  amount  of  DMSO  in  these  samples   disrupting  the  fluorescent  Cl-­‐  complexes,  as  was  seen  in  the  lysed  vesicle  solutions.   Simple  injection  of  1a·∙TFA  into  buffered  Cl-­‐  solution  such  that  the  final  concentration  is   10%  DMSO/H2O  yields  spectra  with  strong  emission  at  530  nm,  akin  to  the  vesicle   studies  (Figure  6).       Figure  6.  Fluorescence  of  1a·∙TFA  in  DMSO  injected  into  DMSO  (blue  trace),  high  Cl-­‐   buffered  H2O  (red  trace)  and  H2O  buffered  with  no  Cl-­‐  content  (green  trace).         123      This  longer  wavelength  emission  is  indicative  of  an  energy  transfer  mechanism   and  may  be  attributable  to  a  static,  ground-­‐state  π-­‐stacked  complex  achievable  only   with  inclusion  of  a  relatively  small  anion  such  as  Cl-­‐,  which  would  explain  the  lower   intensity  bands  and  bathochromic  shifting  of  the  emission.  While  the  exact  mechanism   behind  the  appearance  of  this  emission  band  in  Cl-­‐-­‐containing  cells  and  vesicles  remains   elusive,  the  disruption  of  the  emission  with  high  concentrations  of  molecularly   dissolving  solvent  (e.g.,  DMSO,  lysing  surfactants)  in  solution  and  the  quenching  of  the   530  nm  emission  band  upon  heating  are  strong  indicators  of  a  Cl-­‐  dependent  complex   and  an  intermolecular  energy  transfer  mechanism.       B.  Anion-­‐induced  Supramolecular  Assemblies  of  Other  Urea  Receptors       During  the  preparation  of  solutions  of  1a·∙TFA  and  1b·∙TFA  for  the  aggregation   induced  emission  studies,  a  curious  dependence  upon  the  order  of  operations  was   observed.  Protonation  of  the  receptors  in  apolar  organic  solvents,  followed  by  collection   of  the  resultant  orange  solid  either  by  precipitation  or  concentration  yielded  yellow  to   orange  solutions  upon  dissolving  in  DMSO,  indicative  of  protonation  of  the  pyridyl  lone   pair.  Contrarily,  dissolving  the  neutral  receptor  in  DMSO  and  adding  acid,  even  in  vast   excess,  would  never  result  in  yellow  solutions  and  UV-­‐Vis  absorbance  spectra  indicated   that  the  receptor  remained  unprotonated  in  solution.         In  an  attempt  to  address  this  phenomenon,  the  receptors  were  taken  up  in  non-­‐ hydrogen  bonding  MeCN  instead  of  DMSO,  but  this  resulted  in  the  same  behavior  as   noted  above.  Exposure  of  solutions  of  the  neutral  receptors  to  a  slightly  stronger  acid,   124     HBF4,  would  change  the  color  of  the  solution  slightly  at  extremely  high  HBF4   concentration,  but  the  general  trend  stayed  the  same:  solutions  of  1a  and  1b  in  polar   organic  media  would  only  exhibit  the  absorbance  bands  indicative  of  protonation  if  they   were  pre-­‐protonated  in  an  apolar  solvent.  While  it  seems  apparent  that  the  difference   in  pKa  of  both  the  protonated  receptor  and  the  acid  in  each  of  these  solvents  could   account  for  this  observation,  the  pre-­‐protonated  receptors  would  remain  orange  and   exhibit  the  UV-­‐Vis  absorbance  indicative  of  protonation  in  solutions  of  DMSO  or  MeCN   until  exposed  to  base.  This  instilled  in  us  the  idea  that  there  may  be  an  aggregate  or   ordered  stack  in  solution  to  account  for  this  apparent  incongruity.     Anion-­‐dependent  Fluorescent  Aggregates.  Taking  solutions  of  1a·∙HBF4  and  1b·∙HBF4  in   MeCN  and  exposing  them  to  different  anions  as  TBAX  salts  yielded  unexpected  results   (Figure  8).       Figure  7.  (a)  Top:  solutions  of  1b•HBF4  with  TBAX  in  acetonitrile,  bottom:  under  365  nm   light.  (b)  Top:  1a•HBF4  with  the  same  anions  as  (a)  in  acetonitrile,  bottom:  under  365   nm  light.  The  clear  solutions  containing  AcO-­‐  and  H2PO4-­‐  are  indicative  of  deprotonation   by  these  more  basic  anions.   BF4- Cl Br- I- AcO- NO3- ClO4- H2PO4- HSO3- BF4- Cl Br- I- AcO- NO3- ClO4- H2PO4- HSO3- A B 125         Figure  8.  Fluorescence  emission  of  1b·∙HBF4  with  TBANO3  in  the  solid  state.  Inset:  the   larger  precipitate  which  formed  ~10  min  after  exposure  to  TBANO3  (under  365  nm  light).       In  solutions  of  both  1a·∙HBF4  and  1b·∙HBF4  exposure  to  basic  anions  (acetate  and   hydrogen  phosphate)  resulted  in  deprotonation  of  the  receptor,  and  the  resultant   solution  was  colorless.  With  the  exception  of  1b·∙HBF4  and  tetrabutylammonium  nitrate,   none  of  the  solutions  exhibited  noticeable  fluorescence  emission  under  365  nm  light.   The  striking  selectivity  of  1b·∙HBF4  for  nitrate  in  MeCN  was  intriguing,  but  after  letting   the  solutions  sit  overnight  the  fluorescence  emission  was  gone.  At  the  bottom  of  the  vial   was  a  highly  green  fluorescent  precipitate.  Repetition  of  the  above  experiment  showed   that  the  green  fluorescence  observable  in  solutions  containing  NO3-­‐  was  in  fact  a  finely   distributed  precipitate  (Figure  8).  These  aggregated  into  larger  particles  and  settled   from  solution  over  time,  leading  to  a  non-­‐fluorescent  supernatant  solution  and   fluorescent,  amorphous  solids  at  the  bottom.  Solid-­‐state  fluorescence  of  the  precipitate   with  373  nm  excitation  yielded  spectra  with  a  maximum  at  530  nm,  in  agreement  with   the  color  of  the  precipitate  in  MeCN  solution  (Figure  8).  These  fluorescent  particles  were   intriguing,  and  followed  the  AIE  trend  noted  above,  although  the  aggregation  seemed  to   be  induced  by  addition  of  the  nitrate  anion  in  this  case.     126       Transmission  Electron  Microscopy.  While  TEM  and  SEM  techniques  would  both  be   effective  probes  of  the  macroscopic  topology  of  the  receptor  aggregates,  only  TEM  data   will  be  presented  here  due  to  its  relative  completeness.  The  receptor  was  deposited   onto  lacy  carbon  grids  to  investigate  the  nanoscale  assembly  of  1b·∙HBF4  aggregates  with   anions,  in  particular  the  nitrate  anion.  Treatment  of  MeCN  solutions  of  1b·∙HBF4  exposed   to  MeCN  solutions  containing  high  millimolar  quantities  of  tetrabutylammonium  salts  of   the  anions  used  in  the  aggregation  studies  reported  earlier  in  this  chapter.  TEM  images   were  collected  on  lacy  carbon  grids  by  floating  the  grids  upside  down  on  drops  of  the   receptor  and  salt  solutions  on  glass  slides.  After  30  seconds  the  grids  were  removed  and   allowed  to  dry  before  being  introduced  to  the  vacuum  chamber  of  the  instrument   (Figure  9).             Figure  9.  TEM  image  of  1b·∙HBF4  on  lacy  carbon  (scale  bar  inset).       127           Figure  10.  TEM  images  of  1b·∙HBF4  after  exposure  to  TBANO3.  The  globular  particles  seen   in  Figure  9  now  exhibit  finer  and  more  ordered  edges.  At  right  is  a  close-­‐up  of  these   aggregates.             Images  of  1b·∙HBF4  obtained  from  MeCN  are  composed  strictly  of  large,   amorphous  aggregates  with  no  fine  structure  and  soft,  globular  edges.  Addition  of  a   small  amount  of  tetrabutylammonium  nitrate  to  the  solution  of  1b·∙HBF4  used  in  Figure   10  results  in  sharper,  feathered  particles  which  fluoresce  green  under  UV  light.  Blank   images  (of  just  MeCN,  and  MeCN  with  TBANO3)  have  no  visible  particles  present  on  the   lacy  carbon,  even  at  high  magnification  (Appendix  D).       The  structural  change  upon  introduction  of  nitrate  led  us  to  question  the   influence  of  the  size  of  the  anion  on  the  mesoscopic  topology  of  the  particles.  Would   smaller  anions  allow  for  tighter  packing  and  more  ordered  structures,  or  would  the   particles  be  uniformly  smaller  and  more  monodisperse?         Treatment  of  the  receptor  with  tetrabutylammonium  chloride  instead  of  nitrate   led  to  the  formation  of  long  rods,  some  of  which  spanned  multiple  grid  windows  while   128     being  only  100  –  150  nm  wide  (Figure  11;  blank  images  of  TBACl  in  Appendix  D).  This   topology  was  only  observed  with  TBACl,  as  treatment  with  TBABr  led  to  disordered   clumps  of  rods;  these  unordered  structures  are  an  apparent  midpoint  between  the   particulate  seen  with  nitrate  or  tetrafluoroborate  and  the  rods  formed  upon  exposure   to  chloride  (Figure  12).           Figure  11.  TEM  images  of  1b·∙HBF4  exposed  to  TBACl.  The  long  rods  formed  under  these   conditions  are  100-­‐200  nm  across,  and  can  be  up  to  hundreds  of  microns  long,  spanning   multiple  grid  windows  with  little  to  no  branching.   129       Figure  12.  TEM  image  of  1b·∙HBF4  after  exposure  to  TBABr.         Upon  closer  inspection  of  the  rods  seen  in  the  Cl-­‐-­‐  containing  images  we  noticed   striations  in  the  longitudinal  direction  of  the  rod.  This  pattern  is  consistent  with  clumps   of  smaller  rods  packed  together  to  form  the  longer  wires,  although  additional   microscopy  techniques  are  still  needed  to  confirm  this  observation  (e.g.,  SEM   topographical  images).  A  good  illustration  of  these  rope-­‐like  striations  observed  in  all  of   the  TBACl  experiments  can  be  seen  in  Figure  13.  We  tentatively  attribute  this  to  the   formation  of  long,  linear  molecular  aggregates  containing  Cl-­‐  anions  incorporated  in  the   interior  cavities  along  the  length  of  the  rod,  which  subsequently  stack  together  like   fibers  in  a  rope  to  form  the  wider  striated  aggregates  observable  at  TEM  magnification.   130         Figure  13.  TEM  images  illustrating  the  striated  pattern  in  the  rods.  The  image  at  top  is   approximately  2  µm  wide.       131         Crystal  structures  of  1b  offer  some  support  for  the  columnar  stacking  interaction   hypothesized  above.  In  crystals  grown  from  DMSO  1b  exists  as  a  monomer  with  no   intermolecular  H-­‐bonding  interactions  between  receptors  (Chapter  IV,  Figure  12).   Crystals  grown  from  MeCN,  however,  take  the  same  general  conformation  but   incorporate  H2O  into  the  cavities.  The  hydrogen  bonds  in  the  network  of  H2O  molecules   and  urea  groups  in  each  of  the  cavities  sew  together  the  interdigitated  infinite  columns   (Figure  14).                         Figure  14.  ORTEP  representation  (thermal  ellipsoids  at  the  50%  probability  level)  of  the   crystal  structure  of  1b  grown  from  MeCN.  (Left)  the  conformation  of  each  monomeric   receptor;  (middle)  the  infinite  columnar  stack  of  interdigitated  receptors;  (right)  space-­‐ filling  model  of  the  structure  of  the  two  strings  of  H2O  that  sew  the  columnar  structure   together.         The  distance  between  each  receptor  is  3.37-­‐4.01  Å,  with  pyridine  N●●●HOH   hydrogen  bond  distance  of  2.90  Å,  NH●●●OH2  distances  of  2.89-­‐3.80  Å  and  C=O●●●HOH   bond  distance  of  2.86  Å.  The  two  receptors  in  each  stack  are  brick-­‐and-­‐mortar  offset  by   132     4.05  Å,  about  the  distance  of  the  ethynyl  linkages  between  the  pyridine  and  each  arm.   While  crystal  structure  of  the  protonated  1b  complexes  have  yet  to  be  solved,  it  can  be   imagined  that  the  electrostatic  interactions  between  the  pyridinium  rings  and  their  Cl-­‐   guests  would  offer  an  additional  source  of  stabilization  energy  to  stacks  such  as  these.   Additionally,  one  could  envision  the  larger  trifluoroacetate  anion’s  -­‐CF3  moieties  acting   as  caps  to  the  dimers,  limiting  the  growth  of  the  stacks  in  each  direction.  This  would   result  in  the  smaller,  dimeric  aggregates  that  would  give  rise  to  the  globular  structures   seen  in  Figure  9,  while  replacement  with  Cl-­‐  would  allow  the  receptor  complexes  to   aggregate  more  closely,  thus  forming  the  wire-­‐like  structures  seen  in  Figure  11.  This   anion-­‐induced  aggregation  phenomenon  led  us  to  begin  investigation  of  whether  or  not   there  was  evidence  of  the  formation  of  ordered  aggregates  or  stacks  in  solution  prior  to   precipitation.     Circular  Dichroism.  We  turned  to  circular  dichroism  spectroscopy  to  investigate  the   aggregation  phenomenon  in  dilute  solution.  Chiral  analogs  of  the  urea  receptors  were   synthesized:  a  simple  model  urea  4,  and  analogs  of  1a  and  1b  (Scheme  1).  The  first  chiral   receptor  4,  an  analog  of  the  alkyl  urea  receptors  previously  reported,  was  synthesized   by  treatment  of  3  with  commercially  available    (R)-­‐(+)-­‐α-­‐methylbenzyl  isocyanate  in   toluene.               133         Scheme  1.  Synthesis  of  chiral  urea  compounds  4,  8  and  12.               Chiral  1a  analog  8  was  synthesized  first  by  treatment  of  methylparaben  with   commercially  available  citronellyl  bromide  under  basic  conditions.  The  chiral  ester  5  was   subsequently  saponified  with  lithium  hydroxide  in  methanol  at  30  oC,  followed  by     134     hydrogenation  in  THF  to  yield  6  in  quantitative  yield  over  the  two  steps.  Carboxylic  acid   6  was  treated  with  oxalyl  chloride  in  dichloromethane  in  the  presence  of  catalytic  DMF.   The  crude  acid  chloride  was  carried  on  to  the  acyl  azide  without  purification  by   treatment  with  sodium  azide  in  acetone.  The  crude  acyl  azide  was  then  converted  to  the   isocyanate  by  Curtius  rearrangement  at  80  oC  in  toluene.  Treatment  of  the  isocyanate   with  dianiline  3  yielded  8,  the  analog  of  1a  in  46%  yield  over  the  4  steps.       Lastly,  chiral  1b  analog  12  was  synthesized  first  by  treatment  of  citronellol  with   p-­‐nitrobenzoyl  chloride  in  pyridine,  yielding  the  nitrophenyl  ester  9  in  moderate  yield.   Hydrogenation  of  this  compound  yielded  the  chiral  aniline  10  in  quantitative  yield,   which  was  carried  on  to  the  isocyanate  by  treatment  with  phosgene  in  slightly  acidic   toluene.  Isocyanate  11  was  carried  on  to  the  final  product  without  purification  by   treatment  of  3  in  toluene  with  11,  yielding  the  product  in  18%  isolated  yield.       The  optoelectronic  spectra  of  4,  8  and  12  in  CHCl3  conform  to  the  trends   observed  in  each  of  these  classes:  alkyl  analog  4  is  fluorescent  as  the  freebase,   quenched  when  protonated  with  TFA,  and  recovers  but  red  shifts  in  its  emission  upon   exposure  to  Cl-­‐;  and  electron-­‐poor  12  is  OFF-­‐ON  in  its  response  (Appendix  D).       135         Figure  15.  (Left)  CD  spectra  of  4  with  decreasing  concentration  (start:  7  µM  final:  0.5   µM);  (right)  CD  spectra  of  4  with  increasing  TBACl  concentration  (7  µM  4  from  0  to  6.8   equiv  TBACl).       Circular  dichroism  spectra  of  4  were  collected  in  CHCl3,  and  resemble  typical   random  coil  spectra  at  shorter  wavelengths  (Figure  15).16  During  dilution  experiments  it   was  apparent  from  7  µM  to  0.5  µM  that  the  linear  change  in  intensity  of  the  CD   spectrum  with  decreasing  concentration  was  consistent  with  simply  a  decrease  in  the   presence  of  4.  The  attribution  of  this  CD  response  to  absorbance  by  the  arylethynyl   scaffold  was  confirmed  by  CD  spectra  of  control  solutions  of  the  chiral  benzyl  moiety   alone,  which  exhibited  no  CD  response  in  the  300-­‐375  nm  portion  of  the  spectrum.  CD   spectra  match  the  absorbance  bands  seen  in  UV-­‐Vis  experiments  and  are  visible  out  to   375  nm,  indicating  structural  influence  from  the  chiral  positions  on  the  absorbing   ethynylpyridine  backbone.  This  influence  is  most  likely  through  intermolecular   interaction  due  to  the  lack  of  conjugation  between  the  pendant  phenyl  rings  and  the   scaffold  and  our  previous  assertions  about  the  dimeric  nature  of  the  neutral  ureas  in   Decreasing concentration 136     solution.  Supporting  this  hypothesis  is  the  DFT-­‐calculated  lowest  energy  “W”   conformation  of  the  freebase  form  of  the  urea  receptors,  which  would  not  result  in   chiral  transfer  from  the  benzyl  groups  to  the  scaffold  in  monomers  of  4  in  this   conformation  due  to  the  distance  between  the  arms  in  this  conformation  (Chapter  IV).   Treatment  of  neutral  4  with  tetrabutylammonium  chloride  at  7  µM  yielded  no  change  in   the  CD  spectrum,  signaling  either  no  Cl-­‐  binding  or  a  lack  of  influence  of  Cl-­‐  binding  on   the  structure  of  the  neutral  receptor  in  solution  (Figure  15).   Titration  with  trifluoroacetic  acid  was  more  enlightening  (Figure  16).  The  splitting   observed  in  the  CD  spectrum  at  the  π-­‐π*  transition  band  at  330  nm  during  titration  with   TFA  can  be  assigned  to  positive  exciton  coupling  between  chromophores,  and  to  a  right-­‐ handed  twist  to  the  interacting  π-­‐systems.16  Since  the  absorbing  species  in  the  non-­‐ conjugated  (R)-­‐(+)-­‐methylbenzyl  rings  is  not  in  conjugation  with  the  scaffold,  for  CD   activity  to  be  seen  in  the  low  energy  end  of  the  spectrum  the  chiral  information  must  be   transferred  to  the  arylethynylpyridine  moiety.  This  can  happen  either  by  static   conformational  influence  in  the  monomer  or  through  the  shape  of  the  intermolecular   aggregates.     137         Figure  16.  CD  spectra  of  4  during  titration  of  TFA  in  CHCl3  at  7  µM  receptor  (0  –  28  µM   TFA).  (Inset)  Isotherm  of  the  change  in  mDeg  (absolute)  during  the  titration  at  445  nm   shows  that  this  change  in  the  spectra  is  a  function  of  the  protonation  of  the  pyridine,  as   the  isotherm  levels  after  1  equiv.     Since  the  intensity  of  exciton  coupling  of  this  type  is  dependent  upon  the   distance  between  chromophores  it  can  be  assumed  that  this  bisignate  Cotton  effect  at   the  π-­‐π*  band  in  the  protonated  receptor  arises  either  from  tightly  associated   aggregates  or  enforced  chirality  in  the  arene  scaffold  due  to  the  conformation  of  the   arms  of  the  receptor  around  the  anionic  guest  (Figure  17).  16     138       Figure  17.  Illustrative  MM3  minimized  model  of  the  simplest  chiral  conformation  of  the   arylethynyl  pyridine  scaffold  in  4.  (Left)  Top  view  of  a  model  representation  of  4  and   (right)  side  view  illustrating  the  right-­‐handed  helical  twist  in  the  backbone  that  could   give  rise  to  a  CD  response  in  the  low  energy  region  of  the  spectra  of  monomers  of   4·∙TFA;  however,  the  data  support  a  more  complex  intermolecular  arene-­‐arene   interaction.     Treatment  of  the  end  point  of  the  TFA-­‐4  titrations  with  tetrabutylammonium   chloride  intensifies  and  shifts  the  absorbance  bands.  While  there  is  no  further  change  in   the  bisignate  nature  of  the  CD  spectrum,  these  further  changes  in  the  spectra  indicate  a   slight  difference  in  conformation  in  solution  between  the  two  complexes,  indicative  of   incorporation  of  Cl-­‐    into  the  structure  (Figure  18).  The  decrease  in  the  absorbance  bands   at  330  –  360  nm  is  consistent  with  a  decrease  in  the  electronic  dipole  moment  that   could  be  attributed  to  a  closer  pyridinium  NH●●●X  distance  than  that  found  with   trifluoroacetate.  This  red-­‐shifting  of  the  entire  spectrum  is  also  indicative  of  closer   arene-­‐arene  interactions,  lending  credence  to  the  argument  for  aggregate  formation.16     139       Figure  18.  Comparison  of  4,  4·∙TFA  and  4·∙TFA  with  a  slight  excess  of  TBACl.           Circular  dichroism  studies  with  the  chiral  analogs  of  1a  and  1b,  and  treatment  of   the  protonated  receptors  with  TBANO3  are  underway  and  have  thus  far  not  provided   any  stronger  evidence  of  stacking  than  those  with  4  presented  above.  While  the  data   presented  in  this  section  are  incomplete,  even  the  weak  evidence  of  ordered  stacking   observed  thus  far  in  these  experiments  is  supportive  of  the  general  behavior  of  the   achiral  receptors  in  both  solution  and  the  solid-­‐state.  Future  work  on  this  project  will   focus  on  elucidating  the  structures  of  these  receptors  in  concentrated  solution,  and   relate  these  structural  features  to  the  optoelectronic  responses  observed  in  this  family   of  compounds.       Conclusions       This  chapter  focused  on  both  the  application  of  urea-­‐functionalized   phenylethynyl  scaffolds  to  in  vitro  imaging,  fluorescent  sensing  of  NO3-­‐  anion  in  organic   140     media  by  aggregation  induced  emission,  and  the  self-­‐assembled  aggregates  of  these   receptors  around  appropriately  sized  anionic  guests  to  form  topographically  distinct   nanostructures.         In  summary,  the  fluorescence  behavior  and  discrete,  selective  responses  to   target  analytes  exhibited  by  urea-­‐functionalized  anilinoethynyl  pyridine  structures   augers  well  for  their  application  as  cellular  probes  for  anions  and  as  building  blocks  of   well-­‐defined  nanoscale  architectures.  The  columnar  stacking  observed  in  the  solid-­‐state   is  tentatively  supported  in  even  dilute  solution,  and  seems  to  be  dependent  upon  the   anion  involved.  Anion-­‐mediated  self-­‐assembly  into  well-­‐defined  structures  is  a  lively   field  of  research  now,  making  these  results  exciting  for  the  prospects  of   arylethynylpyridine-­‐based  research.  Future  work  applying  the  design  principles  learned   from  this  first  generation  of  fluorionophores  should  lead  to  more  effective  and   differentially  selective  materials  suitable  for  application  in  advanced  bioimaging  and   high-­‐performance  supramolecular  materials.     Experimental       General  Details.  1H  and  13C  NMR  spectra  were  obtained  on  a  Varian  300  MHz   spectrometer  (  1H  299.95  Hz,  13C  75.43  Hz)  or  Inova  500  MHz  spectrometer  (1H  500.10   MHz,  13C  125.75  MHz)  or  Varian  Inova  600  (1H  599.98  MHz,  13C  150.86  MHz)   spectrometer.  Chemical  shifts  (∂)  are  expressed  in  ppm  downfield  from   tetramethylsilane  (TMS)  using  non-­‐deuterated  solvent  present  in  the  bulk  deuterated   solvent  (CDCl3:  1H  7.26  ppm,  13C  77.0  ppm;  CD2Cl2:  1H  5.32  ppm  13C  54.0  ppm).  Unless   141     otherwise  specified,  solvents  were  obtained  from  distillation  using  published  literature   procedures  directly  before  use.     Mass  spectra  were  acquired  on  a  Thermo  Finnigan  LCQ  Deca  XP  Plus  electrospray   ionization  spectrometer  in  positive  mode  in  MeOH  solvent.       UV-­‐Vis  spectra  were  acquired  with  a  Hewlett-­‐Packard  8453  UV-­‐Visible   spectrophotometer  equipped  with  a  250  nm  cutoff  filter.       Fluorescence  data  were  acquired  with  a  Horiba  Jobin-­‐Yvon  FluoroMax-­‐4   fluorescence  spectrophotometer  equipped  with  an  integrating  sphere.  All  spectra   were  uncorrected  for  lamp  response  unless  otherwise  specified.  All  slit  widths   (ex/em)  were  held  constant  at  5  nm/5  nm,  and  quantifiable  data  was  obtained  by   correction  of  the  spectra  to  lamp  response  and/or  integrating  sphere  reflectivity.       Circular  dichroism  spectra  were  acquired  on  a  Jasco  J-­‐815  CD   Spectropolarimeter  in  standard  sensitivity  mode  (50-­‐100  nm/min  scan  rate)  at  20  oC.       Experimental  conditions  for  fluorescence  measurements,  excitation  spectra,   vesicle  preparation  and  1H-­‐NMR  data  can  be  found  in  Appendix  D.           Methylbenzyl  urea  4.  All  glassware  was  flame-­‐dried  before  use.  Dianiline  3   (800  mg,  1.9  mmol)  was  reacted  with  (R)-­‐(+)-­‐α-­‐methylbenzyl  isocyanate  (3  equiv)  in   25  mL  toluene  with  stirring  for  3  h  under  N2.  Following  concentration  in  vacuo,  the   crude  product  was  filtered  through  a  short  silica  plug  (2:1  hexanes/CHCl3).   Trituration  with  Et2O  afforded  4  (82%)  as  an  amorphous  white  solid.  1H-­‐NMR  (600   MHz,  CDCl3):  δ  8.01  (d,  J  =  8.9  Hz,  2H),  7.51  (t,  J  =  7.8  Hz,  1H),  7.44  (br  s,  2H),  7.41  (d,   142     J  =  2.4  Hz,  2H),  7.35  (d,  J  =  7.8  Hz,  2H),  7.32-­‐7.28  (m,  6H),  7.21  (t,  J  =  7.8  Hz,  4H),  7.13   (t,  J  =  7.2  Hz,  2H),  6.26  (br  s,  2H),  4.94  (pentet,  J  =  7.2  Hz,  2H),  1.41  (d,  J  =  7.2  Hz,  6H),   1.28  (s,  18H);  13C-­‐NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  154.76,  144.91,  144.19,  142.87,  138.89,   128.45,  126.06,  119.39,  109.84,  92.97,  87.64,  34.18,  31.25,  31.19.       Methylester  5.  To  a  10  mL   round  bottomed   flask  equipped  a   stir  bar,   reflux   condensor  and  N2  inlet  was  added  methyl  paraben  (100  mg,  0.657  mmol),  citronellyl   bromide   (152  mg,  0.696  mmol),  potassium  carbonate   (93  mg,  0.670  mmol)   in  5  mL   acetone.   The   mixture   was   refluxed   20   h.   Upon   completion,   the   reaction   was   concentrated  in  vacuo,  taken  up  in  15  mL  EtOAc  and  washed  thrice  with  water.  After   drying   over  MgSO4,   the   crude  material   was   concentrated   in   vacuo   and   purified   by   column  chromatography  (10%  EtOAc/hexanes)  to  yield  a  colorless  oil  (82%).  1H-­‐NMR   (300  MHz,  CDCl3):  δ  7.98  (d,  J  =  8.7  Hz,  2H),  6.90  (d,  J  =  8.7  Hz,  2H),  5.10  (unresolved   tt,  J  =  1.5,  4.2  Hz,  1H),  4.03  (m,  2H),  2.00  (pentet,  J  =  7.5  Hz,  2H),  1.84  (m,  1H),  1.64-­‐ 1.53  (m,  8H),  1.40-­‐1.20  (m,  2H),  0.96  (d,  J  =6.3  Hz,  3H).         Carboxylic  acid  6.  To  a  25  mL  round  bottomed  flask  containing  LiOH  (72  mg,   1.72  mmol)  in  2:1  MeOH/H2O  (12  mL)  was  added  the  ester  5  (100  mg,  0.344  mmol)   as  a  solution  in  MeOH  (4  mL)  such  that  the  final  ratio  was  3:1  MeOH/H2O.  The   resulting  mixture  was  stirred  at  35  oC  for  24  h  and  cooled  to  rt.  A  dilute  NH4Cl   solution  was  added  until  the  pH  reached  8.  This  solution  was  then  treated  dropwise   with  dilute  aqueous  acetic  acid  until  the  pH  reached  5.  This  was  acidified  with   aqueous  HCl  until  white  precipitate  was  formed  (pH  4).  The  precipitate  was  collected   by  suction  filtration  and  dried  with  EtOH.  This  white  precipitate  was  taken  up  in  15   143     mL  THF/TEA  (5:1)  in  a  Parr  flask,  to  which  was  added  5%  Pd/C  (50  mg)  and  the   suspension  was  shaken  with  H2  at  45  psi  for  45  minutes.  Upon  completion  the   reaction  was  acidified  with  10%  aqueous  HCl,  filtered  and  dried  over  MgSO4  to  yield   7  quantitatively.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.09  (d,  J  =  4.8  Hz,  2H),  6.96  (d,  J  =4.8   Hz,  2H),  5.12  (unresolved  tt,  J  =  1.8,  5.4  Hz,  1H),  4.08  (m,  2H),  2.03  (septet,  J  =  7.5  Hz,   2H),  1.85  (pentet,  4.8  Hz,  1H),  1.69  (m,  8H),  1.43-­‐1.21  (m,  3H),  0.97  (d,  J  =  6.3  Hz,   3H).       Alkoxyphenyl  urea  8.  In  a  flame-­‐dried  50  mL  round  bottomed  flask  was  added   7  (100  mg,  0.342  mmol)  in  20  mL  dichloromethane  under  argon.  Oxalyl  chloride  (56.4   mg,  0.444  mmol)  was  added  followed  by  2  drops  DMF.  This  solution  was  allowed  to   stir  to  completion  (until  bubbles  stopped  forming,  2  h)  whereupon  it  was  evaporated   to  dryness,  forming  a  glass  on  the  walls  fo  the  flask.  To  this  was  added  3  mL  acetone   and  cooled  to  0  oC  in  an  ice  bath.  Sodium  azide  (26.5  mg,  0.408  mmol)  was  added  as   a  solution  in  water  (1  mL)  and  this  was  allowed  to  reach  rt  over  3  h.  Upon   completion  the  solution  was  evaporated  to  dryness  in  vacuo  and  rediluted  in  10  mL   freshly  distilled  toluene  and  evaporated  again  in  vacuo.  This  was  repeated  thrice,   whereupon  a  an  additional  10  mL  dry  toluene  was  added  and  the  solution  was   brought  to  90  oC.  Once  bubbling  stopped  (~3  h),  dianiline  3  (60  mg,  0.142  mmol)  was   added  and  the  solution  allowed  to  stir  3  h.  Upon  completion,  the  reaction  was   concentrated  in  vacuo  and  purified  by  column  chromatography  (15-­‐50%   EtOAc/hexanes,  5%  TEA)  to  yield  a  semi-­‐pure  product.  This  was  subsequently  taken   up  in  1  mL  CHCl3  and  purified  by  GPC  (retention  time  46  min  at  3  mL/min)  to  yield   144     the  product  (88  mg,  46%)  as  a  colorless  solid.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.15  (d,  J   =  8.7  Hz,  4H),  7.72  (s,  2H),  7.33  (m,  13H),  6.72  (d,  J  =  8.7  Hz,  4H),  3.86  (t,  J  =  7.2  Hz,   4H),  1.80-­‐1.5  (m,  8H),  1.36-­‐1.10  (m,  38H),  0.96  (d,  J  =  4.5  Hz,  6H),  0.90  (d,  J  =  6.6  Hz,   12H).  13C-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  202.69,  161.10,  154.06,  152.43,  150.21,  146.31,   144.41,  138.60,  136.31,  135.78,  130.06,  122.40,  116.99,  95.26,  74.11,  46.86,  44.96,   43.88,  41.81,  38.87,  37.46,  35.58,  32.28,  30.33,  27.26.       Nitrobenzene  9.  In  a  flame-­‐dried  50  mL  round  bottomed  flask  was  combined   nitrobenzoyl  chloride  (1.06  g,  5.73  mmol)  and  pyridine  (20  mL).  The  flask  was  cooled   to  0  oC  in  an  ice  bath  and  to  this  was  added  citronellol  (1  mL,  5.46  mmol)  dropwise.   The  reaction  was  allowed  to  reach  rt,  whereupon  it  was  concentrated  in  vacuo  and   taken  up  in  EtOAc.  This  was  washed  thrice  with  saturated  NaHCO3  followed  by  brine   and  dried  over  MgSO4.  Concentration  yielded  the  product  as  a  yellowish  oil  (182  mg,   71%).  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CDCl3):  δ  8.30  (d,  J  =8.7  Hz,  2H),  8.20  (d,  J  =  8.7  Hz,  2H),   5.09  (unresolved  tt,  1H),  4.40  (t,  J  =6.9  Hz,  2H),    2.01  (pentet,  J  =  7.8  Hz,  2H),  1.82  (m,   2H),  1.67-­‐1.59  (m,  9H),  1.46-­‐1.34  (m,  1H),  1.25  (pentet,  J  =  7.5  Hz,  2H),  0.982  (d,  J  =   6.3  Hz,  3H).       Alkylbenzoate  aniline  10.  In  a  Parr  flask  was  combined  in  15  mL  THF/TEA   (5:1)  9  (1.00g,  3.27  mmol)  and  30%  Pd/C  (55  mg).  The  flask  was  pressurized  with  H2   (45  psi)  and  allowed  to  shake  for  3h.  Upon  completion  the  mixture  filtered  through   Celite  and  concentrated  in  vacuo  to  yield  a  yellowish  oil  (900  mg,  99%).  1H-­‐NMR  (300   MHz,  CDCl3):  δ  7.86  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  6.67  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  4.29  (t,  J  =  6.9  Hz,  2H),       145     1.99  (pentet,  J  =  7.5  Hz,  1H),  1.76  (m,  1H),  1.67-­‐1.52  (m,  8H),  1.32-­‐1.13  (m,  7H),  0.87   (d,  J  =  8.6  Hz,  3H),  0.85  (d,  J  =  7.5  Hz,  6H).       Alkylbenzoate  urea  12.  To  a  flame-­‐dried  50  mL  three-­‐neck  round  bottomed   flask  equipped  with  a  stirbar,  reflux  condensor,  N2  bubbler  and  addition  funnel  (25   mL)  was  added  20%  phosgene  in  toluene  (9g,  18.03  mmol).  A  salt  suspension  was   formed  by  bubbling  anhydrous  HCl  through  10  (500  mg,  1.80  mmol)  in  toluene  (20   mL)  and  this  was  added  to  the  addition  funnel.  The  reaction  flask  was  heated  to  90   oC  and  dropwise  addition  of  the  aniline  salt  was  carried  out  overnight.  The  reaction   solution  was  then  evaporated  to  ½  its  volume  whereupon  3  was  added  (250  mg,  0.60   mmol)  and  the  reaction  was  stirred  to  completion  by  TLC  (10%  EtOAc/hexanes).   Upon  completion,  the  reaction  was  concentrated  in  vacuo  and  taken  back  up  in   CHCl3.  The  organics  were  washed  thrice  with  saturated  NaHCO3  and  brine  and  dried   over  MgSO4.  Purification  by  GPC  (retention  time  49  min  at  3  mL/min)  yielded  the   pure  product  (88  mg)  as  an  orange  solid.  1H-­‐NMR  (300  MHz,  CHCl3):  δ  8.81  (br  s,  2H),   8.20  (br  s,  2H),  8.00  (d,  J  =    8.7  Hz,  2H),  7.918  (t,  J  =  8.8  Hz,  1H),  7.81  (d,  J  =  8.1  Hz,   4H),  7.48  (m,  J  =  8.4  Hz,  4H),  7.39-­‐7.29  (m,  8H),  4.28  (t,  J  =  7.2  Hz,  4H),  1.77  (pentet,   4H),  1.66-­‐1.47  (m,  5H),  1.37-­‐1.14  (m,  28H),  0.94  (d,  J  =  6.3  Hz,  6H),  0.86  (d,  J  =  6.6  Hz,   12H).  13C-­‐NMR  (600  MHz,  DMSO-­‐d6):  δ  166.27,  152.64,  145.61,  142.84,  137.56,   130.63,  128.97,  128.16,  126.35,  124.59,  119.16,  118.24,  109.88,  92.83,  87.64,  63.42,   39.19,  37.16,  35.58,  34.22,  31.17,  30.01,  27.92,  24.61,  22.68,  22.59,  19.62.       146         CHAPTER  VI         CONCLUDING  SUMMARY         The  work  presented  herein  represents  two  main  focal  areas  of  my  doctoral   research:  the  design  and  synthesis  of  fluorescent  receptors  and  the  study  of  their  self-­‐ assembled  complexes  with  anions.  This  project  had  its  genesis  in  both  the  metal  cation   self-­‐assembly  and  anion-­‐π  research  of  the  Darren  W.  Johnson  lab  and  the  metallated   arylethynyl  scaffolds  and  optoelectronic  materials  being  investigated  in  the  Michael  M.   Haley  lab  at  the  time.    The  course  of  research  that  led  from  these  two  seemingly   disparate  fields  to  a  sensor  for  anions,  and  ultimately  a  fluorescent  probe  for  chloride   that  functioned  in  vitro,  led  me  to  focus  much  of  my  efforts  on  the  mechanisms  of   photoluminescence  in  these  molecules.     Research  started  with  a  survey  of  the  synthetic  ionophore  and  sensor  literature   to  identify  ideal  targets  and  design  strategies,  which  was  partially  summarized  in  the   introductory  chapter  of  this  dissertation.  The  incorporation  of  rigid  phenylacetylenic   linkers  was  found  to  lend  tenability  both  to  the  optoelectronic  responses  and  the   solution-­‐phase  shape-­‐persistence  of  the  sensor,  and  is  a  key  structural  feature  in  this   class  of  receptors.  Additionally,  these  easily  functionalizable  moieties  allow  for  facile   expansion  or  contraction  of  the  conjugation  in  the  fluorophore,  thereby  lending  us  a   simple  pathway  to  binding  site  size  and  bite-­‐angle  modification  while  eschewing  the   typical  fluorophore-­‐spacer-­‐receptor  motif  of  many  synthetic  probes.   147     The  proof-­‐of-­‐principle  work  outlined  in  Chapter  II  convinced  us  that  our  design   strategy  was  viable.    The  well  documented  binding  behavior  of  metal  cations  was  used   to  test  the  hypothesis  that  perturbation  of  the  electronic  system  in  our  receptor  scaffold   would  result  in  easily  observable  changes  in  the  receptor’s  optoelectronic  output  upon   binding.  The  confirmation  of  this  behavior  in  our  system  allowed  us  to  begin  tuning  our   probe  design  towards  anionic  targets.   The  results  of  our  halide  binding  studies  in  both  solution  and  the  solid  state  were   outlined  in  Chapter  III.  Binding  studies  focused  on  the  urea-­‐functionalized  receptors  due   to  the  complex  speciation  apparent  in  solutions  of  sulfonamide-­‐functionalized   compounds  and  the  apparent  [1  +  1]  binding  stoichiometry  in  the  protonated  ureas.   While  the  neutral  receptors  showed  a  preference  for  the  smaller  halides,  this  trend  was   reversed  upon  protonation  and  the  strength  of  the  binding  interaction  was  increased  by   at  least  an  order  of  magnitude.     Chapter  IV  focused  on  the  fluorescence  responses  of  the  receptor.  In  electron-­‐ rich  receptors  containing  a  pendant  phenyl  ring  the  fluorescence  emission  observable  in   the  neutral  state  was  effectively  quenched  upon  protonation.  This  trend  was  reversed  in   solutions  of  the  electron-­‐poor  receptors.  In  those  functionalized  without  a  direct  urea   NH-­‐phenyl  linkage  on  the  pendant  moiety  the  fluorescence  emission  could  be  recovered   upon  treatment  with  chloride.  These  results  were  promising  for  the  use  of   functionalized  arylethynylpyridine  scaffolds  as  probes  in  both  binary  (ON-­‐OFF  or  OFF-­‐ ON)  or  tertiary  (ON-­‐OFF-­‐ON)  modes.  The  mechanisms  behind  this  fluorescence  were   found  to  be  governed  by  excimeric  interactions  in  the  case  of  OFF-­‐ON  receptors,   148     whereas  the  ON-­‐OFF  response  appeared  to  be  due  to  mundane  pyridinium  electron   transfer  quenching.  The  excimer-­‐like  behavior  observed  in  the  OFF-­‐ON  responsive   receptors  is  attributable  to  ground-­‐state  complexes,  rather  than  excited-­‐state   interactions  in  solution.     In  vitro  assays  yielded  surprising  preliminary  results,  which  were  outlined  in   Chapter  V.  Unexpectedly,  the  ON-­‐OFF  response  in  the  methoxyphenyl-­‐functionalized   urea  receptor  was  inverted,  and  this  receptor  functioned  as  an  OFF-­‐ON  responsive   probe  for  Cl-­‐  in  cellular  matrices.  The  mechanism  governing  this  newly  observed   fluorescence  is  unclear,  but  seems  to  be  due  to  aggregation  induced  emission  in  poor   solvents  such  as  water.  Restricted  intermolecular  rotation  in  the  aggregated  sensor   gives  rise  to  some  of  the  emission,  while  close-­‐contact  intermolecular  interactions  in  Cl-­‐   induced  assemblies  of  this  receptor  gives  rise  to  excimer-­‐like  green  fluorescence,  even   in  competitive  hydrogen-­‐bonding  media.  This  anion-­‐induced  effect  was  the  key  to   signaling  for  Cl-­‐,  and  seems  to  be  exploitable  in  the  nitrophenyl  urea  functionalized   receptors  as  well.  Preliminary  results  from  TEM  studies  of  the  nanoscale  self-­‐assembly   observed  upon  evaporation  of  acetonitrile  from  this  receptor  were  also  reported.  These   results  underscore  the  need  for  more  investigation  of  the  aggregate  structure  and  the   self-­‐assembly  process,  and  are  the  obvious  direction  to  take  this  research  in  the  future.     149         APPENDIX  A       SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  II:   SYNTHESIS  OF  FIRST  GENERATION  DERIVATIVES  AND  PROOF  OF  PRINCIPLE       Titration  Data   In  all  titrations  care  was  taken  to  keep  the  receptor  concentration  constant   during  the  titration.  A  stock  solution  of  receptor  was  prepared  and  the  guest  serial   dilution  was  prepared  with  the  stock  receptor  solution.  Receptor  concentration  was   thus  kept  constant  while  titrating  in  the  guest  solution  to  avoid  concentration  effects   and  to  provide  clean  isosbestic  points  in  the  UV  spectra.  All  additions  were  done   through  septa  with  a  Hamilton  gas-­‐tight  syringe.  Titrations  were  carried  out  in  triplicate.   Representative  data  are  provided  for  each  set.     Zn(NO3)2  Titration.  A  3.07  mM  solution  of  Zn(NO3)2  and  a  3.07  µM  solution  of  13  were   prepared.  Starting  vol  in  cuvet  of  1  mL.   anion  stock  added  (ml)   mol  anion  total   [X-­‐]  M   0   0   0   0.01   3.42532E-­‐08   1.71265E-­‐05   0.01   6.85065E-­‐08   3.42529E-­‐05   0.01   1.0276E-­‐07   5.13791E-­‐05   0.01   1.37013E-­‐07   6.85051E-­‐05   0.01   1.71266E-­‐07   8.56309E-­‐05   0.01   2.05519E-­‐07   0.000102757   0.01   2.39773E-­‐07   0.000119882   0.01   2.74026E-­‐07   0.000137007   0.01   3.08279E-­‐07   0.000154133   0.01   3.42532E-­‐07   0.000171258   0.02   4.11039E-­‐07   0.000205507   150     0.02   4.79545E-­‐07   0.000239756   0.02   5.48052E-­‐07   0.000274004   0.02   6.16558E-­‐07   0.000308251   0.02   6.85065E-­‐07   0.000342498   0.02   7.53571E-­‐07   0.000376744   0.02   8.22078E-­‐07   0.000410989   0.02   8.90584E-­‐07   0.000445234   0.02   9.59091E-­‐07   0.000479478   0.02   1.0276E-­‐06   0.000513721   0.04   1.16461E-­‐06   0.000582206   0.04   1.30162E-­‐06   0.000650688   0.04   1.43864E-­‐06   0.000719167   0.04   1.57565E-­‐06   0.000787643   0.04   1.71266E-­‐06   0.000856117   0.08   1.98669E-­‐06   0.000993056   0.08   2.26071E-­‐06   0.001129984   0.08   2.53474E-­‐06   0.001266901   0.08   2.80877E-­‐06   0.001403807   0.08   3.08279E-­‐06   0.001540702   0.16   3.63084E-­‐06   0.00181446   0.32   4.72695E-­‐06   0.002361843   0.32   5.82305E-­‐06   0.002909052     Table  1.  Representative  titration  conditions  for  13  and  Zn(II).     Figure  1.  Isotherm  plotted  by  following  the  absorbance  at  400  nm  of  13  during  Zn(II)   titration.   151     APPENDIX  B     SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  III:    ANION  BINDING:  SELECTIVITY  EFFECTS  AND  SOLID-­‐STATE  CONFORMATION       Titration  Details   In  all  titrations  care  was  taken  to  keep  the  receptor  concentration  constant  during  the   titration.  A  stock  solution  of  receptor  was  prepared  and  the  guest  serial  dilution  was   prepared  with  the  stock  receptor  solution.  Receptor  concentration  was  thus  kept   constant  while  titrating  in  the  guest  solution  to  avoid  concentration  effects  on  the  urea   N–H  proton  chemical  shifts  and  provide  clean  isosbestic  points  in  the  UV  spectra.  All   additions  were  done  through  septa  with  a  Hamilton  gas-­‐tight  syringe.  Titrations  were   carried  out  in  triplicate  and  the  reported  binding  constants  represent  the  average  of  the   fits  from  three  titrations.  Representative  data  are  provided  for  each  set.   NMR  Titration  Conditions.  1H  NMR  titrations  were  carried  out  on  an  Inova  500   MHz  spectrometer  (1H  500.10  MHz).  Chemical  shifts  (δ)  are  expressed  in  ppm  downfield   from  tetramethylsilane  (TMS)  using  non-­‐deuterated  solvent  present  in  the  bulk   deuterated  solvent  (CDCl3:  1H  7.26  ppm).  CDCl3  was  passed  over  activated  alumina  and   saturated  with  deionized  water  (1:1  v/v  CDCl3  and  water  were  mixed  in  a  separatory   funnel  and  the  organic  layer  was  collected).  Tetrabutylammonium  salts  were  used  as   purchased  from  TCI  America.   152     Tetrabutylammonium  chloride.  A  10  mL  stock  solution  of  2a  (12.60  mg,  [R]=1.60   mM)  in  CDCl3  was  prepared  and  used  in  the  dilution  of  TBACl  guest  solution  (9.11  mg,   [G]=16.40  mM).  Starting  volume  of  700  µL.     Addition  (uL)   Volume  of  Anion  (uL)   [TBACl]   Equivalents   s   s   0   0   0.00E+000   0   8.073   7.806   5   5   1.16E-­‐004   0.07254619   8.184   7.854   5   10   2.31E-­‐004   0.144070602   8.282   7.897   5   15   3.43E-­‐004   0.214594673   8.374   7.938   5   20   4.55E-­‐004   0.284139243   8.461   7.976   5   25   5.65E-­‐004   0.352724577   8.541   8.011   5   30   6.73E-­‐004   0.420370387   8.610   8.041   5   35   7.80E-­‐004   0.487095845   8.681   8.072   5   40   8.85E-­‐004   0.552919608   8.745   8.101   5   45   9.89E-­‐004   0.61785983   8.803   8.126   5   50   1.09E-­‐003   0.681934183   8.855   8.150   5   55   1.19E-­‐003   0.745159869   8.907   8.171   5   60   1.29E-­‐003   0.807553638   8.953   8.193   5   65   1.39E-­‐003   0.869131802   8.996   8.211   5   70   1.49E-­‐003   0.92991025   9.034   8.228   5   75   1.58E-­‐003   0.989904459   9.075   8.246   5   80   1.68E-­‐003   1.049129512   9.111   8.262   Table  1.  Representative  titration  table  for  TBACl  titration  with  2a.   153     Figure  1.  Representative  1H-­‐NMR  spectra  during  the  titration  of  2a  with  TBACl.   154     Figure  2.  Isotherms  formed  from  plotting  the  urea  chemical  shifts  during  2a  titration   with  TBACl  in  CDCl3.       155     Figure  3.  Non-­‐linear  regressional  fits  of  the  chemical  shifts  of  the  urea  protons  with  RMS   residuals.   Tetrabutylammonium  bromide.  A  10  mL  stock  solution  of  2a  (10.90  mg,   [R]=1.38  mM)  in  CDCl3  was  prepared  and  used  in  the  dilution  of  TBABr  guest  solution   (34.8  mg,  [G]=54.00  mM).  Starting  volume  of  700  µL.   156     Addition  (uL)   Volume  of  Anion  (uL)   [TBABr]   Equivalents   s   s   0   0   0.00E+000   0.000   8.086   7.810   2   2   1.54E-­‐004   0.111   8.160   7.843   2   4   3.07E-­‐004   0.221   8.214   7.867   2   6   4.59E-­‐004   0.331   8.270   7.890   2   8   6.10E-­‐004   0.440   8.316   7.912   2   10   7.60E-­‐004   0.549   8.364   7.932   2   12   9.10E-­‐004   0.657   8.407   7.951   2   14   1.06E-­‐003   0.764   8.445   7.969   2   16   1.21E-­‐003   0.871   8.484   7.986   2   18   1.35E-­‐003   0.977   8.522   8.001   2   20   1.50E-­‐003   1.083   8.557   8.017   2   22   1.64E-­‐003   1.188   8.591   8.032   2   24   1.79E-­‐003   1.292   8.624   8.046   2   26   1.93E-­‐003   1.396   8.652   8.059   2   28   2.08E-­‐003   1.499   8.681   8.071   2   30   2.22E-­‐003   1.602   8.708   8.082   5   35   2.57E-­‐003   1.856   8.773   8.112   5   40   2.92E-­‐003   2.107   8.828   8.136   5   45   3.26E-­‐003   2.354   8.879   8.159   5   50   3.60E-­‐003   2.598   8.927   8.184   5   55   3.93E-­‐003   2.839   8.967   8.197   5   60   4.26E-­‐003   3.077   9.007   8.214   10   70   4.91E-­‐003   3.543   9.072   8.243   10   80   5.53E-­‐003   3.997   9.131   8.268   10   90   6.15E-­‐003   4.440   9.179   8.289   10   100   6.75E-­‐003   4.872   9.222   8.308   Table  2.  Representative  titration  table  for  the  titration  fo  2a  with  TBABr  in  CDCl3.   157     Figure  4.  1H-­‐NMR  spectra  of  the  titration  of  2a  with  TBABr  in  CDCl3.   158     Figure  5.  Isotherms  formed  from  plotting  the  chemical  shifts  of  the  urea  protons  of  2a   during  titration  with  TBABr.       159     Figure  6.  Non-­‐linear  regressional  fits  of  the  isotherms  in  Figure  5.   Tetrabutylammonium  iodide.  A  10  mL  stock  solution  of  2a  (11.60  mg,  [R]=1.47   mM)  in  CDCl3  was  prepared  and  used  in  the  dilution  of  TBAI  guest  solution  (36.3  mg,   [G]=54.00  mM).  Starting  volume  of  700  µL.  Titration  to  2  equiv  with  5  µL  aliquots   160     showed  no  shift  in  the  N-­‐H  protons  from  the  initial  spectrum.  Plotting  N-­‐H  chemical   shifts  vs  [TBAI]  yielded  flat  isotherms.    No  binding  was  measurable.     UV-­‐Vis  Titration  Conditions   UV-­‐Vis  titrations  held  the  receptor  concentration  constant  as  in  the  1H  NMR   titrations.  Spectroscopically  pure  CH3CN  was  passed  over  basic  alumina,  dried  over  4  Å   molecular  sieves,  and  used  immediately.  Tetrabutylammonium  salts  were  purchased   from  TCI  America  and  purified  by  recrystallization  and  heating  above  the  melting  point   in  vacuo  or  by  sublimation.   Tetrabutylammonium  chloride.  A  10  mL  stock  solution  of  2a•TFA  (6.01  mg,  7.77   µmol)  in  CH3CN  was  prepared  and  used  in  the  dilution  of  TBACl  guest  solution  (5.02  mg,   18.00  µmol).  Serial  dilution  to  [Host]=  6.00  x  10-­‐5  ;  [Guest]=  4.00  x  10-­‐4.  Host  starting   volume  of  2  mL.                     161       Additions   Total  TBACl  (mL)   mol  Cl-­‐  Delivered   [Cl]  Cuvett   0   0   0   0   1   0.01   4.00E-­‐06   2.00E-­‐06   2   0.02   8.00E-­‐06   4.00E-­‐06   3   0.03   1.20E-­‐05   6.00E-­‐06   4   0.04   1.60E-­‐05   8.00E-­‐06   5   0.05   2.00E-­‐05   1.00E-­‐05   6   0.06   2.40E-­‐05   1.20E-­‐05   7   0.07   2.80E-­‐05   1.40E-­‐05   8   0.08   3.20E-­‐05   1.60E-­‐05   9   0.09   3.60E-­‐05   1.80E-­‐05   10   0.1   4.00E-­‐05   2.00E-­‐05   11   0.11   4.40E-­‐05   2.20E-­‐05   12   0.12   4.80E-­‐05   2.40E-­‐05   13   0.13   5.20E-­‐05   2.60E-­‐05   14   0.14   5.60E-­‐05   2.80E-­‐05   15   0.15   6.00E-­‐05   3.00E-­‐05   16   0.3   1.20E-­‐04   6.00E-­‐05   17   0.45   1.80E-­‐04   9.00E-­‐05   18   0.6   2.40E-­‐04   1.20E-­‐04   19   0.75   3.00E-­‐04   1.50E-­‐04   20   0.9   3.60E-­‐04   1.80E-­‐04   21   1.05   4.20E-­‐04   2.10E-­‐04   22   1.2   4.80E-­‐04   2.40E-­‐04   23   1.35   5.40E-­‐04   2.70E-­‐04   24   1.5   6.00E-­‐04   3.00E-­‐04   25   1.65   6.60E-­‐04   3.30E-­‐04   Table  3.  Representative  titration  table  for  titration  of  2a·∙TFA  with  TBACl.   TBACl Ph-Urea•TFA 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 300 350 400 450 500 550 600 nm A b s Figure  7.  UV-­‐Vis  spectra  illustrating  the  change  in  absorbance  during  titration  of  2a·∙TFA   with  TBACl.   162     Figure  8.  Non-­‐linear  regressional  fit  of  the  change  in  absorbance  during  titration  of   2a·∙TFA  with  TBACl.   Tetrabutylammonium  bromide.  A  10  mL  stock  solution  of  2a•TFA  (6.01  mg,  7.77   µmol)  in  CH3CN  was  prepared  and  used  in  the  dilution  of  TBABr  guest  solution  (12.26   mg,  38.03  µmol).  [Host]=  8.20  x  10-­‐5  ;  [Guest]=  1.82  x  10-­‐3.  Host  starting  volume  of  2.00   mL.     Additions   Total  TBABr  (mL)   mol  Br-­‐   Delivered   [Br-­‐]  Cuvett   0   0   0   0   1   0.01   1.82E-­‐05   9.10E-­‐06   2   0.02   3.64E-­‐05   1.82E-­‐05   3   0.03   5.46E-­‐05   2.73E-­‐05   4   0.04   7.28E-­‐05   3.64E-­‐05   5   0.05   9.10E-­‐05   4.55E-­‐05   6   0.06   1.09E-­‐04   5.46E-­‐05   7   0.07   1.27E-­‐04   6.37E-­‐05   163     8   0.08   1.46E-­‐04   7.28E-­‐05   9   0.09   1.64E-­‐04   8.19E-­‐05   10   0.1   1.82E-­‐04   9.10E-­‐05   11   0.15   2.73E-­‐04   1.37E-­‐04   12   0.2   3.64E-­‐04   1.82E-­‐04   13   0.25   4.55E-­‐04   2.28E-­‐04   14   0.3   5.46E-­‐04   2.73E-­‐04   15   0.35   6.37E-­‐04   3.19E-­‐04   Table  4.  Representative  titration  table  for  2a·∙TFA  titration  with  TBABr.     TBABr Ph-Urea•TFA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 300 350 400 450 500 550 600 nm A b s Figure  9.  UV-­‐Vis  spectra  illustrating  the  change  in  absorbance  during  titration  of  2a·∙TFA   with  TBABr.   164     Figure  10.  Non-­‐linear  regressional  fit  of  the  change  in  absorbance  with  TBABr   concentration  during  titration  into  2a·∙TFA.   Tetrabutylammonium  iodide  A  10  mL  stock  solution  of  2a•TFA  (3.95  mg,  5.11  µmol)   was  prepared  and  used  in  the  dilution  of  TBAI  guest  solution  (10.65  mg,  1.98  µmol).   [Host]=  2.60  x  10-­‐5  ;  [Guest]=  1.39  x  10-­‐3.  Host  starting  volume  of  2.00  mL.   Additions   Total  X  (mL)   mol  X  Delivered   [X]  Cuvett   0   0   0   0   1   0.005   6.95E-­‐06   3.48E-­‐06   2   0.01   1.39E-­‐05   6.95E-­‐06   3   0.015   2.09E-­‐05   1.04E-­‐05   4   0.02   2.78E-­‐05   1.39E-­‐05   5   0.025   3.48E-­‐05   1.74E-­‐05   6   0.035   4.87E-­‐05   2.43E-­‐05   7   0.045   6.26E-­‐05   3.13E-­‐05   8   0.055   7.65E-­‐05   3.82E-­‐05   9   0.065   9.04E-­‐05   4.52E-­‐05   10   0.075   1.04E-­‐04   5.21E-­‐05   165     11   0.085   1.18E-­‐04   5.91E-­‐05   12   0.095   1.32E-­‐04   6.60E-­‐05   13   0.105   1.46E-­‐04   7.30E-­‐05   14   0.115   1.60E-­‐04   7.99E-­‐05   15   0.125   1.74E-­‐04   8.69E-­‐05   16   0.155   2.15E-­‐04   1.08E-­‐04   17   0.185   2.57E-­‐04   1.29E-­‐04   18   0.215   2.99E-­‐04   1.49E-­‐04   19   0.245   3.41E-­‐04   1.70E-­‐04   20   0.275   3.82E-­‐04   1.91E-­‐04   21   0.325   4.52E-­‐04   2.26E-­‐04   22   0.375   5.21E-­‐04   2.61E-­‐04   23   0.425   5.91E-­‐04   2.95E-­‐04   24   0.475   6.60E-­‐04   3.30E-­‐04   25   0.525   7.30E-­‐04   3.65E-­‐04   26   0.675   9.38E-­‐04   4.69E-­‐04   27   0.825   1.15E-­‐03   5.73E-­‐04   Table  5  .  Representative  titration  table  for  2a·∙TFA  with  TBAI.     TBAI Ph Urea•TFA 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 350 370 390 410 430 450 470 490 510 530 550 nm A b s Figure  11.  UV-­‐Vis  spectra  of  the  change  in  absorbance  during  titration  of  2a·∙TFA  with   TBAI.   166     Figure  12.  Non-­‐linear  regressional  fit  of  the  isotherm  formed  from  plotting  the  change  in   absorbance  during  titration  of  2a·∙TFA  with  TBAI.   DFT  Details     B3LYP/6-­‐31G  =  -­‐2299.19660605  au   B3LYP/6-­‐31G  Zero  Point  Corrected  Energy  =  -­‐ 2298.626895  au   NIMAG  =  0      C                                    0.35263200        0.60728600        5.12140200    C                                    0.33553500        0.69053800        3.71895000    N                                  -­‐0.71221500        0.11757500        3.04393000    C                                  -­‐1.73773900      -­‐0.55234600        3.66829700    C                                  -­‐1.71217000      -­‐0.66162900        5.07047700    C                                  -­‐0.66972200      -­‐0.07436400        5.78621900    C                                    1.35943000        1.32442700        2.98609000    C                                  -­‐2.77565400      -­‐1.06595700        2.87306100    C                                    2.31329700        1.86008000        2.43895000    C                                  -­‐3.70952600      -­‐1.45302000        2.18267500    C                                    3.43451600        2.48056000        1.83347800    C                                  -­‐4.79245400      -­‐1.80392500        1.34758000    C                                    3.83157600        3.76120100        2.28914100    C                                    4.94661400        4.39301400        1.75656200    C                                    5.68876800        3.73792600        0.76070200    C                                    5.32520800        2.47739600        0.29396700    C                                    4.18834400        1.82090200        0.81198000    C                                  -­‐4.95390600      -­‐1.15541300        0.07934100    C                                  -­‐6.10078500      -­‐1.45277100      -­‐0.68456400    C                                  -­‐7.03364300      -­‐2.37663300      -­‐0.21944200    C                                  -­‐6.86716400      -­‐3.03527300        1.01138200    C                                  -­‐5.75512500      -­‐2.74441800        1.78802200    N                                    3.76966900        0.56361900        0.37209800    N                                  -­‐3.96681800      -­‐0.26255800      -­‐0.33407500    C                                    4.54856000      -­‐0.36386300      -­‐0.34521400    C                                  -­‐4.09896800        0.73676100      -­‐1.31238200    N                                  -­‐2.94553800        1.47734100      -­‐1.44378100    O                                  -­‐5.15476900        0.92654100      -­‐1.95755000    C                                  -­‐2.71700800        2.57542600      -­‐2.30684300    O                                    5.75511200      -­‐0.16802600      -­‐0.62097700    N                                    3.83706300      -­‐1.49226500      -­‐0.68354800    C                                    4.33310200      -­‐2.66411700      -­‐1.30434100    C                                    3.40521900      -­‐3.69784300      -­‐1.54216900    C                                    3.81438600      -­‐4.89157200      -­‐2.13642200    C                                    5.15294300      -­‐5.07932800      -­‐2.50199800   167      C                                    6.07197700      -­‐4.05157700      -­‐2.26671200    C                                    5.67900700      -­‐2.84702100      -­‐1.67399100    C                                  -­‐1.41817800        3.12071800      -­‐2.30918800    C                                  -­‐1.11210400        4.21388500      -­‐3.11925900    C                                  -­‐2.09368700        4.78222600      -­‐3.94034800    C                                  -­‐3.38204000        4.23751100      -­‐3.93839600    C                                  -­‐3.70635200        3.14188000      -­‐3.13148400    H                                  -­‐0.73893700        0.17049900        1.98455100    C                                  -­‐0.27060800      -­‐1.06002400      -­‐1.64027800    F                                    0.68308000      -­‐1.94645400      -­‐2.10469400    F                                  -­‐1.50486700      -­‐1.68892000      -­‐1.72433800    F                                  -­‐0.29471100        0.02599500      -­‐2.50996400    C                                    0.02228000      -­‐0.58473900      -­‐0.20661000    O                                  -­‐0.95769700        0.03667700        0.36431500    O                                    1.16843200      -­‐0.80257300        0.26987300    H                                    1.17481300        1.05900900        5.65900500    H                                  -­‐2.51449500      -­‐1.18997600        5.56696000    H                                  -­‐0.65036400      -­‐0.14962100        6.86767000    H                                    3.24175100        4.23945100        3.06374300    H                                    5.23951600        5.37589000        2.10807500    H                                    6.56550600        4.21825000        0.33820900    H                                    5.91541700        1.97308200      -­‐0.45531800    H                                  -­‐6.24207200      -­‐0.94282000      -­‐1.62530300    H                                  -­‐7.90356900      -­‐2.59312700      -­‐0.83110400    H                                  -­‐7.60029800      -­‐3.75722300        1.35271700    H                                  -­‐5.60703200      -­‐3.22680100        2.74811200    H                                    2.83271400        0.26353500        0.63494700    H                                  -­‐3.05672100      -­‐0.33965200        0.11370600    H                                  -­‐2.14979900        1.18875200      -­‐0.87974900    H                                    2.83881400      -­‐1.48644100      -­‐0.47831100    H                                    2.36460600      -­‐3.55440500      -­‐1.27153100    H                                    3.08385400      -­‐5.67466100      -­‐2.31501800    H                                    5.47131500      -­‐6.00797600      -­‐2.96446300    H                                    7.11280700      -­‐4.18100700      -­‐2.54794900    H                                    6.39044600      -­‐2.05399100      -­‐1.50012300    H                                  -­‐0.64939100        2.67395500      -­‐1.68619900    H                                  -­‐0.10455900        4.61783700      -­‐3.11090900    H                                  -­‐1.85620400        5.63174100      -­‐4.57225000    H                                  -­‐4.15203900        4.66648700      -­‐4.57242400    H                                  -­‐4.70075000        2.72127100      -­‐3.13554500 168         APPENDIX  C     SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  IV:   ANION-­‐DEPENDENT,  SWITCHABLE  ON-­‐OFF  AND  OFF-­‐ON  FLUORESCENCE  EMISSION  IN   BIS(ANILINOETHYNYL)PYRIDINE  DERIVATIVES       UV-­‐visible  and  fluorescence  excitation  spectra     Figure  1  UV-­‐visible  and  fluorescence  spectra  for  1,  1•TFA  and  1•HCl   169       Figure  2  UV-­‐visible  and  fluorescence  spectra  for  2,  2•TFA  and  2•HCl       Figure  3  UV-­‐visible  and  fluorescence  spectra  for  3a,  3a•TFA  and  3a•HCl.  HCl   protonation  results  in  a  fully  non-­‐fluorescent  species  at  any  of  the  absorbing   wavelengths,  thus  no  excitation  spectrum  was  recorded.         Figure  4.  UV-­‐visible  and  fluorescence  spectra  for  3b,  3b•TFA  and  3b•HCl     170       Figure  5.  UV-­‐visible  and  fluorescence  spectra  for  4a,  4a•TFA  and  4a•HCl.  The  dotted   “HCl  ex  (long)”  trace  is  the  excitation  spectrum  when  monitoring  emission  at  535  nm.         Figure  6.  UV-­‐visible  and  fluorescence  spectra  for  4b,  4b•TFA  and  4b•HCl       171       HBr  protonated  fluorescence  emission   0 1 350 400 450 500 550 600 Wavelength (nm) N or m al iz ed I n te n si ty 2b 2b•HBr 2c 2c•HBr   Figure  7.  Fluorescence  emission  in  CHCl3  of  3a  and  3b  with  HBr.  The  dual  emission  in   3b•HBr  is  possibly  from  incomplete  protonation  of  the  receptor,  although  treatment   with  an  excess  of  HBr  exhibited  no  further  change  in  the  spectra.     Self-­‐Association  of  3a.  Self-­‐association  dilution  experiments  for  3a  were  carried  out  in   CDCl3  from  stock  solutions  of  3a  near  the  limit  of  its  solubility  (2.75  mM).  Titrations   started  with  600  µL  of  solution.   Addition   [H]v   Dilution   [H]t   0   600   0   2.75E-­‐03   1   600   50   2.54E-­‐03   2   600   100   2.36E-­‐03   3   600   200   2.06E-­‐03   4   600   300   1.83E-­‐03   5   600   500   1.50E-­‐03   6   600   700   1.27E-­‐03   7   600   900   1.10E-­‐03   8   600   1,100   9.70E-­‐04   9   600   1,500   7.86E-­‐04   3a 3a•HBr 3b 3b•HBr 172     10   600   1,900   6.60E-­‐04   11   600   2,300   5.69E-­‐04   12   600   2,300   5.69E-­‐04     Table  1.  Representative  dilution  data  for  3a  dilution  experiments         Figure  8.  Plot  of  urea  1H  chemical  shifts  in  3a  the  dilution  experiment  in  Table  1.  The   values  are  estimated  and  irreproducible  due  to  the  significant  broadening  of  the   spectra.       3a  2-­‐D  ROESY.  2-­‐D  ROESY  spectra  of  3a  in  water  saturated  chloroform  were  collected  at   3.4  mM.  These  spectra  lacked  the  single  cross-­‐peak  indicative  of  intermolecular   interactions  under  these  conditions.             173           Figure  9.    2-­‐D  ROESY  spectrum  of  3a  in  water-­‐saturated  CDCl3.  Red  circles  indicate   where  the  cross-­‐peaks  should  have  appeared.                             174             Figure  10.  2-­‐D  ROESY  spectrum  of  3b  in  water-­‐saturated  CDCl3  with  no  observable   intermolecular  NOE  cross-­‐peaks.         Positive  mode  ESI-­‐mass  spectral  data.  Positive  mode  mass  spectral  data  were  acquired   under  the  same  conditions  as  those  found  in  the  text.     175       Figure  11.  ESI  pos  mode  spectrum  of  3a·∙TFA   176       Figure  12.  ESI  pos  mode  spectrum  of  3b·∙TFA     Crystal  Data  for  Nitrophenylurea  3b.    Empirical  formula    C48  H55  N7  O9  S2.  Formula   weight    938.11.  Temperature    173(2)  K.  Wavelength    0.71073  Å.  Crystal  system:  Triclinic.   Space  group    P-­‐1.  Unit  cell  dimensions  a  =  13.037(8)  Å  a=  112.755(10)°;  b  =  14.106(9)   Å  b=  103.142(10)°;    c  =  14.707(9)  Å  g  =  92.983(11)°.  Volume  2399(3)  Å3.  Density   (calculated)  1.299  Mg/m3.  Absorption  coefficient  0.173  mm-­‐1.  Crystal  size  0.38  x  0.22  x   0.05  mm3.  Theta  range  for  data  collection  1.58  to  24.00°.  Index  ranges  -­‐14<=h<=14,  -­‐ 16<=k<=16,  -­‐16<=l<=16.  Reflections  collected  20819.  Independent  reflections  7533   [R(int)  =  0.0580].  Completeness  to  theta  =  24.00°  99.9  %.  Absorption  correction  Semi-­‐ empirical  from  equivalents.  Max.  and  min.  transmission  0.9914  and  0.9370.  Refinement   177     method  Full-­‐matrix  least-­‐squares  on  F2.  Data  /  restraints  /  parameters  7533  /  6  /  666.   Goodness-­‐of-­‐fit  on  F2  1.032.  Final  R  indices  [I>2sigma(I)]  R1  =  0.0867,  wR2  =  0.2233.  R   indices  (all  data)  R1  =  0.1382,  wR2  =  0.2502.  Largest  diff.  peak  and  hole  0.609  and  -­‐0.759   e.Å-­‐3       178         APPENDIX  D       SUPPORTING  INFORMATION  FOR  CHAPTER  V:     FUNCTIONALIZED  ANILINOETHYNYLPYRIDINE  UREAS:  IN  VITRO  IMAGING  AND  ANION-­‐ MEDIATED  SELF-­‐ASSEMBLY       Cell  assays.  NIH3T3  murine  fibroblast  cells  were  cultured  on  sterile  18mm  glass  cover   slips  in  DME  Media  containing  9%  FCS  for  4  days  until  near  confluent.  Cover  slips  were   transferred  to  12  well  plates  for  treatment.  The  media  was  aspirated,  and  the  cells  were   incubated  with  a  Cl-­‐  ion  containing  buffer  solution  (120  mM  KCl,  20  mM  NaCl,  1  mM   MgCl2,  1  mM  CaCl2)  for  20  minutes.  The  buffer  was  then  aspirated  and  cells  incubated   with  DMEM  (no  serum)  containing  50uM  of  either  1a  or  1a·∙TFA  in  DMSO  (Diluted  into   media  1:10)  for  45  minutes.  Cover  slips  were  transferred  to  microscope  slides  by   inversion  using  silicone  rubber  o-­‐rings  (17  mm)  to  provide  wells  on  slides  containing  DI   H20,  viewed  and  photographed  with  a  Nikon  epifluorescence  microscope  with  EX  450-­‐ 490nm/EM  515nm.  All  photos  were  at  500X  magnification.     1H-­‐NMR  titration  data.  Solutions  of  1a  in  CDCl3  were  prepared  at  stock  concentration   (5.52  mM)  and  used  to  dilute  the  guest  solutions  such  that  both  [Host]  and  [Guest]  are   equimolar  in  [1a].  The  titrations  started  with  600  µL  of  [Host]  in  the  tube.       179       Addition   [H]v  µL   [Cl]v  µL   [H]t   [Cl]t   1   650   0   2.76E-­‐03   0.00E+00   2   650   25   2.76E-­‐03   4.27E-­‐04   3   650   50   2.76E-­‐03   8.23E-­‐04   4   650   75   2.76E-­‐03   1.19E-­‐03   5   650   100   2.76E-­‐03   1.54E-­‐03   6   650   150   2.76E-­‐03   2.16E-­‐03   7   650   200   2.76E-­‐03   2.71E-­‐03   8   650   300   2.76E-­‐03   3.64E-­‐03   9   650   400   2.76E-­‐03   4.39E-­‐03   10   650   500   2.76E-­‐03   5.01E-­‐03   11   650   600   2.76E-­‐03   5.53E-­‐03   12   650   900   2.76E-­‐03   6.69E-­‐03   13   650   1,200   2.76E-­‐03   7.47E-­‐03   14   650   1,500   2.76E-­‐03   8.04E-­‐03   15   650   1,800   2.76E-­‐03   8.47E-­‐03   Table  1.  Representative  titration  table  of  1a  with  TBACl.       Figure  1.  Non-­‐linear  regressional  fit  to  the  observed  chemical  shifts  during  1a  and  TBACl   titration   180               Addition   [H]v  µL   [NO3]v  µL   Buffer   [H]t   [NO3]t   0   600   0   0   2.75E-­‐03   0.00E+00   1   600   50   0   2.54E-­‐03   6.98E-­‐04   2   600   100   0   2.36E-­‐03   1.30E-­‐03   3   600   200   0   2.06E-­‐03   2.27E-­‐03   4   600   300   0   1.83E-­‐03   3.02E-­‐03   5   600   150   0   2.20E-­‐03   1.81E-­‐03   6   600   200   0   2.06E-­‐03   2.27E-­‐03   7   600   250   0   1.94E-­‐03   2.67E-­‐03   8   600   300   0   1.83E-­‐03   3.02E-­‐03   9   600   350   0   1.74E-­‐03   3.34E-­‐03   10   600   400   0   1.65E-­‐03   3.63E-­‐03   Table  2.  Representative  titration  table  for  1a  and  TBANO3.       Figure  2.  Non-­‐linear  regressional  fit  to  the  observed  chemical  shifts  during  1a  and   TBANO3  titration     181     UV-­‐Vis  titration  data.  Titrations  were  carried  out  in  the  same  manner  as  1H-­‐NMR   titrations.  Fitting  was  done  both  by  HyperQuad  minimization  and  Rose-­‐Drago  fitting.   Stock  concentration:  0.319  mM.     Running   index   [H]v  µL   [Cl]v  µL   [H]t   [Cl]t   1   250   0   3.19E-­‐05   0.00E+00   2   250   50   3.19E-­‐05   4.55E-­‐06   3   250   100   3.19E-­‐05   9.10E-­‐06   4   250   150   3.19E-­‐05   1.36E-­‐05   5   250   250   3.19E-­‐05   2.27E-­‐05   6   250   350   3.19E-­‐05   3.18E-­‐05   7   250   500   3.19E-­‐05   4.55E-­‐05   8   250   650   3.19E-­‐05   5.91E-­‐05   9   250   800   3.19E-­‐05   7.28E-­‐05   10   250   1,000   3.19E-­‐05   9.10E-­‐05   11   250   1,200   3.19E-­‐05   1.09E-­‐04   12   250   1,400   3.19E-­‐05   1.27E-­‐04   13   250   1,600   3.19E-­‐05   1.46E-­‐04   14   250   1,800   3.19E-­‐05   1.64E-­‐04   Table  3.  Representative  titration  table  for  1a·∙TFA  and  TBACl  titration.         182       Figure  3.  Non-­‐linear  regressional  fit  to  the  observed  chemical  shifts  during  1a·∙TFA  and   TBACl  titration.               [H]v  µL   [G]v  µL   An   n=1   3.20E-­‐05   6.67E-­‐06   0.2709   n=2   3.20E-­‐05   2.00E-­‐05   0.3252   n=3   3.20E-­‐05   4.00E-­‐05   0.3461   n=4   3.20E-­‐05   9.34E-­‐05   0.3803   n=5   3.20E-­‐05   1.47E-­‐04   0.3911   Table  4.  Representative  titration  table  for  Rose-­‐Drago  fitting  of  1a·∙TFA  and  TBACl.           Figure  4.  Rose-­‐Drago  plot  for  determining  the  molar  absorptivity  of  the  complex   1a·∙HNO3.  Use  of  this  method  corroborates  non-­‐linear  regressional  methods  by   experimentally  verifying  the  calculated  ε  values.       Vesicle  fluorescence.  1a·∙TFA  in  vesicles  containing  high  Cl-­‐  buffer  in  external  low  Cl-­‐   buffer  were  heated  at  50  oC  for  15  minutes  and  12  h  in  order  to  probe  the  stability  of   183     the  fluorescing  complex  in  solution.  The  530  nm  emission  band  indicative  of  Cl-­‐   concentration  remains  intact  after  short  periods  of  heating.  Extended  periods  of  time  at   high  temperatures  fully  recovered  only  the  high  energy  emission  associated  with  the   receptor  in  solution  and  lacks  the  band  indicative  of  1a·∙Cl  complex.       Figure  5.  Fluorescence  emission  of  a  solution  of  high  Cl-­‐  content  vesicles  in  buffered   water  with  1a·∙TFA  in  DMSO  (10%  DMSO  in  solution)  before,  during,  and  after  heating  at   50  oC.           Aggregation  induced  emission  with  other  anion  solutions.  Both  LiClO4  and  pure  water   were  also  used  to  induce  AIE  fluorescence  in  1a·∙TFA  solutions  in  DMSO.  These  spectra   were  acquired  with  the  same  solutions  as  those  found  in  the  text  (1.96  mM  solutions   diluted  with  varying  amounts  of  aqueous  media).   184       Figure  6.  Fluorescence  emission  upon  introduction  of  LiClO4-­‐containing  water  to  DMSO   solution  of  1a·∙TFA.  Perchlorate  addition  results  in  almost  immediate  aggregate   formation.           Figure  7.  Fluorescence  emission  upon  introduction  of  deionized  water  to  DMSO  solution   of  1a·∙TFA.  No  fluorescence  is  observed  until  the  solution  is  greater  than  50%  H2O  in   DMSO.     185     TEM  microscopy.  Control  images  were  taken  with  only  the  tetrabutylammonium  salts  in   order  to  verify  the  formation  of  structures  consisting  of  1b.         Figure  8.  TEM  image  of  TBANO3  blank  prepared  by  floating  the  grid  on  the  MeCN   solution  of  TBANO3  that  was  added  to  1b·∙HBF4  solution  for  the  images  found  in  the  text.     186       Figure  9.  TEM  image  of  TBACl  blank  prepared  by  floating  the  grid  on  the  MeCN  solution   of  TBACl  that  was  added  to  1b·∙HBF4  solution  for  the  images  found  in  the  text.   Crystal  data  for  Nitrophenylurea  1b.  Empirical  formula    C44  H42  Cl3  N7  O7.  Formula   weight    887.20.  Temperature    173(2)  K.  Wavelength    0.71073  Å.  Crystal  system    Monoclinic.  Space  group    P2(1)/c.  Unit  cell  dimensions  a  =  9.5229(13)  Å  a=  90°;  b  =   39.529(5)  Å  b=  98.282(3)°;    c  =  11.6647(16)  Å  g  =  90°.  Volume  4345.2(10)  Å3.  Z  4  Density   (calculated)  1.356  Mg/m3.  Absorption  coefficient  0.270  mm-­‐1.  F(000)  1848.  Crystal   size  0.21  x  0.14  x  0.02  mm3.  Theta  range  for  data  collection  1.03  to  25.00°.  Index   ranges  -­‐11<=h<=11,  -­‐46<=k<=46,  -­‐13<=l<=13.  Reflections  collected  41736.  Independent   reflections  7661  [R(int)  =  0.0927].  Completeness  to  theta  =  25.00°  100.0  %.  Absorption   correction  Semi-­‐empirical  from  equivalents.  Max.  and  min.  transmission  0.9946  and   0.9455.  Refinement  method  Full-­‐matrix  least-­‐squares  on  F2.  Data  /  restraints  /   parameters  7661  /  0  /  538.  Goodness-­‐of-­‐fit  on  F2  0.996.  Final  R  indices  [I>2sigma(I)]  R1  =   0.0808,  wR2  =  0.1968.  R  indices  (all  data)  R1  =  0.1361,  wR2  =  0.2255.  Largest  diff.  peak   and  hole  0.418  and  -­‐0.316  e.Å-­‐3     187     REFERENCES  CITED     Chapter  I   1.   J.   L.   Sessler,   P.   A.   Gale,   and  W.-­‐S.   Cho,  Anion   Receptor   Chemistry,   Royal   Society   of   Chemistry,  Cambridge,  2006.     2.   W.   -­‐S.   Cho,   J.   L.   Sessler,   Functional   Synthetic   Receptors,   ed.   T.   Schrader,   A.   D.   Hamilton,  Wiley-­‐VCH,  Weinheim,  2005,  165-­‐256.     3.  Supramolecular  Chemistry  of  Anions,  ed.  A.  Bianchi,  K.  Bowman-­‐James  and  E.  Garcia-­‐ España,  Wiley-­‐VCH,  New  York,  1997.     4.  A.  Houssain,  Curr.  Org.  Chem.,  2008,  12,  1231-­‐1256.     5.  K.  Campbell,  R.  R.  Tykwinski,  Carbon-­‐rich  Compounds:  From  Molecules   to  Materials,   ed.  M.  M.  Haley,  R.  R.  Tykwinski,  Wiley-­‐VCH,  New  York,  2006,  229-­‐294.     6.  R.  Welti  and  F.  Diederich,  Helv.  Chim.  Acta,  2003,  86,  494.     7.  C.  -­‐Y.  Huang,  L.  A.  Cabell  and  E.  V.  Anslyn,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1994,  116,  2778.     8.  J.  L.  Sessler,  A.  E.  Vivian,  D.  Seidel,  A.  K.  Burrell,  M.  Hoehner,  T.  D.  Mody,  A.  Gebauer,   S.  J.  Weghorn  and  V.  Lynch,  Coord.  Chem.  Rev.,  2000,  216-­‐217,  411-­‐434.     9.  A.  Jasat  and  D.  Dolphin,  Chem.  Rev.,  1997,  97,  2267-­‐2340.     10.  P.  A.  Gale,  P.  Anzenbacher,  Jr.  and  J.  L.  Sessler,  Coord.  Chem.  Rev.,  2001,  222,  57-­‐102.     11.  P.  Anzenbacher,  Jr.,  R.  Nishiyabu  and  M.  A.  Palacios,  Coord.  Chem.  Rev.,  2006,  250,   2929-­‐2938.     12.   J.   L.  Atwood,  K.   T.  Holman  and   J.  W.   Steed,   J.   Chem.   Soc.,   Chem.  Commun.,   1996,   1401-­‐1407     13.   J.   L.   Sessler,   B.   L.   Rubin,   S.   Camiolo,   W.   -­‐S.   Cho,   G.   D.   Pantos   and   V.   M.   Lynch,   Supramolecular  Chem.,  2006,  18,  103-­‐109.   14.  P.  A.  Gale,  Chem.  Commun.,  2005,  3761-­‐3772.     15.  T.  Evan-­‐Salem,  I.  Baruch,  L.  Avram,  Y.  Cohen,  L.  C.  Palmer  and  J.  Rebek,  Jr.,  Proc.  Nat.   Acad.  Sci.,  2006,  103,  12296-­‐12300.     188     16.  S.  Leininger,  B.  Olenyuk  and  P.  J.  Stang,  Chem.  Rev.,  2000,  100,  853-­‐908.     17.  H.  L.  Anderson  and  J.  K.  M.  Sanders,  Chem.  Commun.,  1996,  946-­‐947.     18.  J.  D.  Ferrara,  C.  Tessier-­‐Youngs  and  W.  J.  Youngs,  Organometallics,  1987,  6,  676-­‐678.     19.   M.   Iyoda,   S.   Sirinintasak,   Y.   Nishiyama,   A.   Vorasingha,   F.   Sultana,   K.   Nakao,   Y.   Kuwatani,  H.  Matsuyama,  M.  Yoshida  and  Y.  Miyake,  Synthesis,  2004,  1527-­‐1531.     20.   J.   D.   Ferrara,   A.   A.   Tanaka,   C.   Fierro,   C.   Tessier-­‐Youngs   and   W.   J.   Youngs,   Organometallics,  1989,  8,  2089-­‐2098.     21.  J.  D.  Ferrara,  A.  Djebli,  C.  Tessier-­‐Youngs  and  W.  J.  Youngs,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1988,   110,  647-­‐649.     22.  J.  D.  Ferrara,  C.  Tessier-­‐Youngs  and  W.  J.  Youngs,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1985,  107,  6719.     23.  P.  N.  W.  Baxter,  Chem.  Eur.  J.,  2003,  9,  2531-­‐2541.     24.  P.  N.  W.  Baxter,  Chem.  Eur.  J.,  2002,  8,  5250-­‐5264.     25.  P.  N.  W.  Baxter  and  R.  Dali-­‐Youcef,  J.  Org.  Chem.,  2005,  70,  4935-­‐4953.     26.   S.   Samori,   S.   Tojo,  M.   Fujitsuka,   E.   L.   Spitler,  M.  M.   Haley   and   T.  Majima,   J.   Org.   Chem.,  2007,  72,  2785-­‐2793.     27.  E.  L.  Spitler,  S.  P.  McClintock  and  M.  M.  Haley,  J.  Org.  Chem.,  2007,  72,  6692-­‐6699.     28.  H.  Zhang,  X.  Wan,  X.  Xue,  Y.  Li,  A.  Yu  and  Y.  Chen,  Eur.   J.  Org.  Chem.,  2010,  1681-­‐ 1687.     29.  E.  L.  Spitler  and  M.  M.  Haley,  Tetrahedron,  2008,  64,  11469-­‐11474.     30.  J.  -­‐H.  Liao,  C.-­‐T.  Chen,  H.-­‐C.  Chou,  C.-­‐C.  Cheng,  P.-­‐T.  Chou,  J.-­‐M.  Fang,  Z.  Slanina  and   T.  J.  Chow,  Org.  Lett.,  2002,  4,  3107-­‐3110.     31.  J.  M.  Fang,  S.  Selvi,  J.  H.  Liao,  Z.  Slanina,  C.  T.  Chen  and  P.  T.  Chou,  J.  Am.  Chem.  Soc.,   2004,  126,  3559.     32.  (a)  M.  Inouye,  T.  Miyake,  M.  Furusyo  and  H.  Nakazumi,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1995,  117,   12416;  (b)  M.  Inouye,  J.  Chiba,  H.  Nakazumi,  J.  Org.  Chem.,  1999,  64,  8170-­‐8176.       33.  S.  Anderson,  U.  Neidlein,  V.  Gramlich,  and  F.  Diederich,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.,   1995,  34,  1596.   189       34.  U.  Neidlein  and  F.  Diederich,  Chem.  Commun.,  1996,  1493.     35.   A.   S.   Droz,   U.   Neidlein,   S.   Anderson,   P.   Seiler   and   F.   Diederich,  Helv.   Chim.   Acta,   2001,  84,  2243.     36.  M.  Inouye,  M.  Waki,  and  H.  Abe,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2004,  126,  2022.     37.  R.  Martínez-­‐Máñez  and  F.  Sancenón,  Chem.  Rev.,  2003,  103,  4419-­‐4476.     38.  E.  Anslyn,  J.  Org.  Chem.,  2006,  72,  687-­‐699.     39.  T.  Gunnlaugsson,  M.  Glynn,  G.  M.  Tocci,  P.  E.  Kruger  and  F.  M.  Pfeffer,  Coord.  Chem.   Rev.,  2006,  250,  3094-­‐3117.     40.  A.  Metzger  and  E.  V.  Anslyn,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.,  1998,  37,  649-­‐651.     41.  S.  A.  Malashikhin,  K.  K.  Baldridge  and  N.  S.  Finney,  Org.  Lett.,  2010,  12,  940-­‐943.     42.  S.  Kondo  and  M.  Sato,  Tetrahedron,  2006,  62,  4844.     43.  J.  E.  Anthony,  S.  I.  Khan  and  Y.  Rubin,  Tetrahedron,  1997,  38,  3499-­‐3502.     44.  M.  Taniguchi,  D.  L.  Cramer,  A.  D.  Bhise,  H.  L.  Kee,  D.  F.  Bocian,  D.  Holten  and   J.  S.   Lindsey,  New.  J.  Chem.,  2008,  32,  947-­‐958.     45.  A.  S.  Droz,  F.  Diederich,  J.  Chem.  Soc.,  Perkin  Trans.  1,  2000,  4224-­‐4226.     46.   J.   K.   Young   and   J.   S.   Moore,  Modern   Acetylene   Chemistry,   ed.   P.   J.   Stang   and   F.   Diederich,  Wiley-­‐VCH,  New  York,  1995,  415-­‐442.     47.  S.  Beer,  C.  G.  Hrib,  P.  G.  Jones,  K.  Brandhorst,  J.  Grunenberg  and  M.  Tamm,  Angew.   Chem.  Int.  Ed.,  2007,  46,  8890-­‐8894.     48.  W.  Zhang  and  J.  S.  Moore,  Adv.  Syn.  Catal.,  2007,  349,  93-­‐120.     49.   K.   G.   Scrimgeour,  Chemistry   and   Control   of   Enzymatic   Reactions,  Academic   Press,   Inc.,  New  York,  1977.     50.  J.  A.  Schetz  and  D.  R.  Sibley,  J.  Pharmacol  Exp.  Ther.,  2001,  296,  359.     51.   (a)  M.   -­‐V.  Martinez-­‐Diaz,  N.   Spencer  and  F.   Stoddart,  Angew.  Chem.   Int.   Ed.   Engl.,   1997,  36,  1904.  (b)  Y.-­‐L.  Huang,  W.-­‐C.  Hung,  C.-­‐C.  Lai,  Y.-­‐H.  Liu,  S.  M.  Peng  and  S.-­‐H.   Chiu,  Angew.  Chem.,  Int.  Ed.,  2007,  46,  6629-­‐6633.   190       52.  M.  H.  Al-­‐Sayah  and  N.  R.  Branda,  Org.  Lett.,  2002,  4,  881.     53.  M.  H.  Al-­‐Sayah  and  N.  R.  Branda,  Angew.  Chem.,  Int.  Ed.  Engl.,  2000,  39,  945.     54.  M.   H.   Filby,   S.   J.   Dickson,   N.   Zaccheroni,   L.   Prodi,   S.   Bonacchi,  M.  Montalti,  M.   J.   Paterson,  T.  D.  Humphries,  C.  Chiorboli  and  J.  W.  Steed,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2008,  130,   4105-­‐4113.     55.  C.  Bucher,  C.  H.  Devillers,  J.  -­‐C.  Moutet,  G.  Royal  and  E.  Saint-­‐Aman,  New  J.  Chem.,   2004,  28,  1584-­‐1589.     56.  H.  Miyaji,  G.  Gasser,   S.   J.  Green,  Y.  Molard,   S.  M.  Strawbridge  and   J.  H.  R.  Tucker,   Chem.  Commun.,  2005,  5355-­‐5357.     57.  M.  Inouye,  K.  Takahashi  and  H.  Nakazumi,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1999,  121,  341.     58.  S.  Rashadan,  M.  E.  Light  and  J.  D.  Kilburn,  Chem.  Commun.,  2006,  4578-­‐4580.     59.  J.  W.  Steed,  Chem.  Soc.  Rev.,  2008,  38,  506-­‐519.     60.  V.  Amendola,  M.  Bonizzoni,  D.  Esteban-­‐Goméz,  L.  Fabrizzi,  M.  Licchelli,  F.  Sancenón   and  A.  Taglietti,  Coord.  Chem.  Rev.,  2006,  250,  1451-­‐1470.     61.  Cercla  Priority  List  of  Hazardous  Substances,  2007,  http://www.atsdr.cdc.gov/cercla.     62.   US   EPA   Case   Study   –   Arsenic   Treatment   Technologies,   Tucson,   Arizona,   2003,   http://www.epa.gov/safewater/arsenic/publications.html.     63.  C.-­‐Q.  Liu,  S.-­‐L.  Li,  Y.-­‐C.  Lang  and  H.-­‐Y.  Xiao,  Env.  Sci.  Technol.,  2006,  40,  6928.     64.   E.   A.   Katayev,  G.   V.   Kolesnikov   and   J.   L.   Sessler,  Chem.   Soc.   Rev.,   2009,  38,   1572-­‐ 1586.     65.  N.  P.  Cherimisinoff,  Pollution  Engineering,  2001,  33,  38.     66.  S.  K.  Maji,  A.  Pal  and  T.  Pal,  J.  Haz.  Mat.,  2008,  151,  811-­‐820.     67   (a)   B.   Gu,   G.  M.   Brown,   P.   V.   Bonnesen,   L.   Liang,   B.   A.  Moyer,   R.   Ober   and   S.   D.   Alexandratos,  Env.   Sci.   Technol.,   2000,  34,   1075;   (b)  W.   Chuoyyok,   R.   J.  Wiacek,   K.   Pattamakomsan,  T.  Sangvanich,  R.  M.  Grudzien,  G.  E.  Fryxell  and  W.  Yantasee,  Env.   Sci.  Technol.,  2010,  44,  3073.     191     68.  R.  Dutzler,  E.  B.  Campbell,  M.  Cadene,  B.  T.  Chait  and  R.  Mackinnon,  Nature,  2002,   415,  287.     69.  G.  Y.  Rychkov,  M.  Pusch,  M.  L.  Roberts,  T.  J.  Jentsch  and  A.  H.  Bretag,  J.  Gen.  Physiol.,   2001,  530,  379-­‐393.     70.  P.  Cudic,  M.  Zinic,  V.  Tomisic,  V.  Simeon,  J.-­‐P.  Vigneron  and  J.-­‐M.  Lehn,  J.  Chem.  Soc.,   Chem.  Commun.,  1995,  1073.     71.  K.-­‐J.  Chang,  D.  Moon,  M.  S.   Lah  and  K.-­‐S.   Jeong,  Angew.  Chem.,   Int.  Ed.,  2005,  44,   7926.     72.  N.-­‐K.  Kim,  K.-­‐J.  Chang,  D.  Moon,  M.  S.  Lah  and  K.-­‐S.   Jeong,  Chem.  Commun.,  2007,   3401-­‐3403.     73.  K.-­‐J.  Chang,  M.  K.  Chae,  C.  Lee,  J.-­‐Y.  Lee  and  K.-­‐S.  Jeong,  Tetrahedron  Lett.,  2006,  47,   6385.     74.  T.  H.  Kwon  and  K.-­‐S.  Jeong,  Tetrahedron  Lett.,  2006,  47,  8539.     75.  A.  T.  Wright,  Z.  Zhong  and  E.  V.  Anslyn,  Angew.  Chem.  Int  Ed.,  2005,  44,  5679-­‐5682.     76.  Z.  Zhong,  E.  V.  Anslyn,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2002,  124,  9014-­‐9015.     77.  A.  N.  Swinburne,  M.  J.  Paterson,  A.  Beeby  and  J.  W.  Steed,  Org.  Biomol.  Chem.,  2010,   8,  1010-­‐1016.     78.  A.  N.  Swinburne,  M.  J.  Paterson,  A.  Beeby  and  J.  W.  Steed,  Chem.  Eur.  J.,  2010,  16,   2714-­‐2718.     79.  O.  Hirata,  M.  Takeuchi  and  S.  Shinkai,  Chem.  Commun.,  2005,  3805-­‐3807.     80.  C.  B.  Black,  B.  Andrioletti,  A.  C.  Try,  C.  Ruiperez  and  J.  L.  Sessler,  J.  Am.  Chem.  Soc.,   1999,  121,  10438-­‐10439.     81.  C.-­‐Y.  Wu,  M.-­‐S.  Chen,  C.-­‐A.  Lin,  S.-­‐C.  Lin  and  S.-­‐S.  Sun,  Chem.  Eur.  J.,  2006,  12,  2263-­‐ 2269.     82.  N.  Pucher,  A.  Rosspeinter,  V.  Satzinger,  V.  Schmidt,  G.  Gescheidt,   J.  Stampfl  and  R.   Liska,  Macromolecules,  2009,  42,  6519-­‐6528.     83.   L.   Porres,   M.   Charlot,   C.   D.   Entwistle,   A.   Beeby,   T.   B.   Marder   and  M.   Blanchard-­‐ Desce,  Proc.  SPIE,  2005,  5943,  559340F.       192     84.  R.  Y.  Tsien,  Nature,  1981,  290,  527.     85.  D.  S.  Bush  and  R.  L.  Jones,  Plant  Physiol.,  1990,  93,  841.     86.   T.   H.   Steinberg,   A.   S.   Newman,   J.   A.   Swanson   and   S.   C.   Silverstein,   J.   Biol.   Chem.,   1987,  262,  8884.     87.  B.  Pilas  and  G.  Durack,  Cytometry,  1997,  28,  316.     88.  A.  D.  Doyle  and  J.  Lee,  Biotechniques,  2002,  33,  358.     89.  R.  Martínez-­‐Zaguilán,  G.  Parnami  and  R.  M.  Lynch,  Cell  Calcium,  1996,  19,  337.     90.  H.  E.  Katerinopoulos,  Curr.  Pharm.  Design,  2004,  10,  3835.     91.  F.  A.  Lattanzio,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.,  1991,  177,  184.     92.  F.  Di  Virgilio,  T.  H.  Steinberg  and  S.  C.  Silverstein,  Cell  Calcium,  1990,  11,  57.     93.  H.  A.  Clark,  R.  Kopelman,  R.  Tjalkens  and  M.  A.  Philbert,  Anal.  Chem.,  1999,  71,  4837.     94.  R.  B.  Silver,  Methods  Cell  Biol.,  1998,  56,  237.     95.  G.  R.  Bright,  G.  W.  Fisher,  J.  Rogowska  and  D.  L.  Taylor,  Methods  Cell  Biol.,  1989,  30,   157.     96.  R.  D.  Carpenter  and  A.  S.  Verkman,  Org.  Lett.,  2010,  12,  1160.     97.  J.  Biwersi,  N.  Farah,  Y.X.  Wang,  R.  Ketchum  and  A.  S.  Verkman,  Am.  J.  Physiol.,  1992,   262-­‐1,  C242.     98.  G.  Grynkiewicz,  M.  Poenie  and  R.  Y.  Tsien,  J.  Biol.  Chem.,  1985,  260,  3440.     99.  N.  D.  Sonawane,  J.  R.  Thiagarajah  and  A.  S.  Verkman,  J.  Biol.  Chem.,  2002,  277,  5506.     100.  J.  I.  Schroeder,  Plant  Mol.  Biol.,  1995,  28,  353.     101.  K.  Renkawek  and  G.  J.  Bosman,  NeuroReport,  1995,  6,  929.     102.  M.  P.  Anderson,  R.  J.  Gregory,  S.  Thompson,  D.  W.  Souza,  S.  Paul,  R.  C.  Mulligan,  A.   E.  Smith  and  M.  J.  Welsh,  Science,  1991,  253,  202.     103.  U.  Kornak,  D.  Kasper,  M.  R.Bosl,  E.  Kaiser,  M.  Schweizer,  A.  Schulz,  W.  Friederich,  G.   Delling  and  T.J.  Jentsch,  Cell,  2001,  104,  205.   193       104.  R.  S.  Kaplan,  J.  Membr.  Biol.,  2001,  179,  165.     105.  R.  J.  Thompson,  H.  C.  S.  R.  Akana,  C.  Finnigan,  K.  E.  Howell  and  J.  H.  Caldwell,  Am.  J.   Physiol.  Cell  Physiol.,  2006,  290,  C499.     106.  S.  F.  Okada,  W.  K.  O’Neal,  P.  Huang,  R.  A.  Nicholas,  L.  E.  Ostrowski,  W.  J.  Craigen,  E.   R.  Lazarowski  and  R.  C.  Boucher,  J.  Gen.  Phys.,  2004,  124,  513.     107.  S.  Zhang,  A.  Finkelstein  and  R.  J.  Collier,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci,  2004,  101,  16756.     108.  M.  Hara-­‐Chikuma,  B.  Yang,  N.D.  Sonawane,  S.  Sasaki,  S.  Uchida  and  A.  S.  Verkman,   J.  Biol.  Chem.,  2005,  280,  1241.     109.  F.  Gasparini,  K.  Lingenhöhl,  N.  Stoehr,  P.  J.  Flor,  M.  Heinrich,  I.  Vranesic,  M.  Biollaz,   H.  Allgeier,  R.  Heckendorn,  S.  Urwyler,  M.A.  Varney,  E.  C.   Johnson,  S.  D.  Hess,  S.  P.   Rao,  A.  I.  Sacaan,  E.  M.  Santori,  G.  Veliçelebi  and  R.  Kuhn,  Neuropharmacology,  1999,   38,  1493.     110.   F.   Gasparini,   H.   Andres,   P.   J.   Flor,  M.   Heinrich,  W.   Inderbitzin,   K.   Lingenhöhl,   H.   Müller,  V.  C.  Munk,  K.  Omilusik,  C.  Stierlin,  N.  Stoehr,  I.  Vranesic  and  R.  Kuhn,  Bioorg.   Med.  Chem.  Lett.,  2002,  12,  407.     111.  M.  Yu,  W.  Tueckmantel,  X.  Wang,  A.  Zhu,  A.  P.  Kozikowski  and  A.-­‐L.  Brownell,  Nucl.   Med.  Biol.,  2005,  32,  631.     112.  J.  M.  Nores,  B.  Biacabe  and  P.  Bonfils,  Ann.  Med.  Interne  (Paris),  2000,  151,  97.     113.  W.  Qu,  S.-­‐R.  Choi,  C.  Hou,  Z.  Zhuang,  S.  Oya,  W.  Zhang,  M.-­‐P.  Kung,  R.  Manchandra,   D.  M.  Skovronsky  and  H.  F.  Kung,  Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.,  2008,  18,  4823.     114.  J.  Dash,  P.  S.  Shirude,  S.-­‐T.  D.  Hsu  and  S.  Balasubramanian,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2008,   130,  15950.         Chapter  II     1. C.  A.  Johnson  II,  B.  A.  Baker,  O.  B.  Berryman,  L.  N.  Zakharov,  M.  J.  O’Connor  and  M.   M.  Haley,  Organomet.  Chem.,  2006,  691,  413-­‐421.     2. C.  N.  Carroll,  O.  B.  Berryman,  C.  A.  Johnson,  L.  N.  Zakharov,  M.  M.  Haley  and  D.  W.   Johnson,  Chem.  Commun.,  2009,  2520.   194       3. W.  B.  Wan  and  M.  M.  Haley,  J.  Org.  Chem.,  2001,  66,  3893-­‐3901.     4. K.  Sonogashira  in  Metal-­‐Catalyzed  Cross-­‐Coupling  Reactions,  P.  J.  Stang  and  F.   Diederich,  Eds.,  Wiley-­‐VCH:  Weinheim,  1997,  203-­‐229.     5. J.  A.  Marsden  and  M.  M.  Haley  in    Metal  Catalyzed  Cross-­‐Coupling  Reactions,  2nd  ed.,   A.  de  Meijere  and  F.  Diederich,  Eds.,  Wiley-­‐VCH:  Weinheim,  2004,  317-­‐394.     6. J.  M.  Heemstra  and  J.  S.  Moore,  Org.  Lett.,  2004,  6,  659-­‐662.     7. T.  L.  Davis  and  K.  C.  Blanchard,  Organic  Syntheses,  1941,  1,    453;  1923,  3,  95.     8. M.  L.  Gross,  D.  H.  Blank  and  W.  M.  Welch,  J.  Org.  Chem.,  1993,  58,  2104-­‐2109.     9. J.  Yan,  J.  Li  and  D.  Cheng,  Synlett,  2007,  2442-­‐2444.     10. S.-­‐Y.  Han  and  Y.-­‐A.  Kim,  Tetrahedron,  2004,  60,  2447-­‐2467.     11. C.  A.  Johnson  II,  Synthesis,  Characterization  and  Materials  Properties  of   Benzocyclynes  and  Metallobenzocyclynes,  Doctoral  Dissertation,  University  of   Oregon,  2007.     12. C.  A.  Johnson  II,  O.  B.  Berryman,  A.  C.  Sather,  L.  N.  Zakharov,  M.  M.  Haley  and  D.  W.   Johnson,  Cryst.  Growth  Des.,  2009,  9,  4247-­‐4249.     13. W.  J.    Vickaryous,  E.  Rather-­‐Healey,  O.  B.  Berryman  and  D.  W.  Johnson,  Inorg.  Chem.,   2005,  44,  9247-­‐9252.     14. T.  G.  Carter,  W.  J.  Vickaryous,  V.  M.  Cangelosi  and  D.  W.  Johnson,  Comm.  Inorg.   Chem.,  2007,  28,  97-­‐122.     15. K.  J.  C.    vam  Bommel,  M.  R.  de  Jong,  G.  A.  Metselaar,  W.  Verboom,  J.  Huskens,  R.   Hulst,  H.  Kooijman,  A.  L.  Spek  and  D.  N.  Reinhoudt,  Chem.  Eur.  J,  2001,  7,  3603-­‐3615.     16. W.  Konigsberg,  Methods  Enzymol.,  1972,  25,  185-­‐188.     17. M.  Sridhar,  S.  K.  Vadivel  and  U.  T.  Bhalerao,  Synth.  Commun.,  1997,  27,  1347-­‐1350.   195       18. J.  Lukkari,  M.  Meretoja,  I.  Kartio,  K.  Laajalehto,  M.  Rajamaki,  M.  Lindstrom  and  J.   Kankare,  Langmuir,  1999,  15,  3529-­‐3537.     19. J.  L.  Kice,  J.  Org.  Chem.,  1963,  28,  957-­‐961.     20. J.  Houk  and  G.  M.  Whitesides,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1987,  109,  6825-­‐6836.     21. J.  Wu,  W.  Liu,  J.  Ge,  H.  Zhang  and  P.  Wang,  Chem.  Soc.  Rev.,  2011,  40,  3483-­‐3495.     22. B.  Valeur  in  Molecular  Fluorescence,  Wiley-­‐VCH:  Weinheim,  2002,  72-­‐123.           Chapter  III     1. (a)  B.  Dietrich,  Pure  Appl.  Chem.,  1993,  65,  1457;  (b)  A.  Bianchi,  K.  Bowman-­‐James,  E.   Garcia-­‐España,  Supramolecular  Chemistry  of  Anions,  Wiley:  New  York,  1997;  (c)  P.  D.   Beer,  P.  A.  Gale,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2001,  40,  486;  (d)  J.  L.  Sessler,  P.  A.  Gale,  W.-­‐S.   Cho,  Anion  Receptor  Chemistry,  The  Royal  Society  of  Chemistry:  Cambridge,  UK,  2006.     2. (a)   J.   Friedman,   Y.   T.  Meharenna,   A.  Wilks,   T.   L.   Poulos,   J.   Biol.   Chem.,   2006,   282,   1066;  (b)  C.  E.  MacBeth,  A.  P.  Golombek,  V.  G.  Young,  Jr.,  C.  Yang,  K.  Kuezera,  M.  P.   Hendrich,  A.  S.  Borovik,  Science,  2000,  289,  938;  (c)  For  a  recent  review  of  anions  in   supramolecular  chemistry,   see:  P.  A.  Gale,  S.  E.  Garcia-­‐Garrido,   J.  Garric,  Chem.  Soc.   Rev.,  2008,  37,  151.     3. (a)  S.  Leininger,  B.  Olenyuk,  P.  J.  Stang  Chem.  Rev.  2000,  100,  853;  (b)  F.  Romero,  R.   Ziessel,  A.  Dupont-­‐Gervais,  A.  van  Dorsselaer    Chem.  Commun.  1996,  4,  551.     4. (a)  A.  J.  Zucchero,  J.  N.  Wilson,  U.  H.  F.  Bunz  J.  Am.  Chem.  Soc.  2006,  128,  11872;  (b)  J.   D.   Lewis,   J.   N.   Moore   Phys.   Chem.   Chem.   Phys.   2004,   6,   4595;   (c)   J.   Tolosa,   A.   J.   Zucchero,  U.  H.  F.  Bunz    J.  Am.  Chem.  Soc.  2008,  130,  6498.     5. (a)   P.   A.   Gale,   Amide   and   Urea   based   Anion   Receptors.   In   The   Encyclopedia   of   Supramolecular  Chemistry,   J.  Atwood,   J.  W.  Steed  Eds.;  Dekker:  New  York,  2004;  pp   31-­‐41;  (b)  V.  A.  Amendola,  D.  Esteban-­‐Gómez,  L.  Fabbrizzi,  M.  Licchelli  Acc.  Chem.  Res.   2006,  39,  343;   (c)  E.  Quinlan,  S.  E.  Matthews,  T.  Gunnlaugsson,  J.  Org.  Chem.,  2007,   72,  7497.     196     6. (a)  M.-­‐V.  Martinez-­‐Diaz,  N.  Spencer,  J.  F.  Stoddart,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.,  1997,   36,  1904;  (b)  M.  H.  Al-­‐Sayah,  N.  R.  Branda,  Org.  Lett.,  2002,  4,  881;  (c)  S.  Rashdan,  M.   E.   Light,   J.   D.   Kilburn,  Chem.   Commun.,   2006,   4578;   (d)   E.   Cordova,   R.   A.   Bissell,  N.   Spencer,  P.  Ashton,  J.  F.  Stoddart,  A.  E.  Kaifer,  J.  Org.  Chem.,  1993,  58,  6550.     7. (a)   C.   A.   Johnson   II,   Synthesis,   Characterization   and   Materials   Properties   of   Benzocyclynes  and  Metallobenzocyclynes,  Doctoral  Dissertation,  University  of  Oregon,   2007.  (b)  O.  B.  Berryman,  C.  A.  Johnson,  L.  N.  Zakharov,  M.  M.  Haley,  D.  W.  Johnson,   Angew.  Chem.  Int.  Ed.,  2008,  47,  117.     8. G.  Blotny,  Tet.  Lett.,  2003,  44,  1499-­‐1501.     9. W.  B.  Wan,  M.  M.  Haley,  J.  Org.  Chem.,  2001,  66,  3893.     10. N.  E.  Kelly,  S.-­‐O.  Lee,  K.  D.  Harris,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2001,  123,  12682.     11. M.  J.  Frisch,  G.  W.  Trucks,  H.  B.  Schlegel,  G.  E.  Scuseria,  M.  A.  Robb,  J.  R.  Cheeseman,   J.  A.  Montgomery,  Jr.,  T.  Vreven,  K.  N.  Kudin,  J.  C.  Burant,  J.  M.  Millam,  S.  S.  Iyengar,   J.  Tomasi,  V.  Barone,  B.  Mennucci,  M.  Cossi,  G.  Scalmani,  N.  Rega,  G.  A.  Petersson,  H.   Nakatsuji,   M.   Hada,   M.   Ehara,   K.   Toyota,   R.   Fukuda,   J.   Hasegawa,   M.   Ishida,   T.   Nakajima,  Y.  Honda,  O.  Kitao,  H.  Nakai,  M.  Klene,  X.  Li,  J.  E.  Knox,  H.  P.  Hratchian,  J.   B.  Cross,  C.  Adamo,  J.  Jaramillo,  R.  Gomperts,  R.  E.  Stratmann,  O.  Yazyev,  A.  J.  Austin,   R.   Cammi,   C.   Pomelli,   J.   W.   Ochterski,   P.   Y.   Ayala,   K.   Morokuma,   G.   A.   Voth,   P.   Salvador,  J.  J.  Dannenberg,  V.  G.  Zakrzewski,  S.  Dapprich,  A.  D.  Daniels,  M.  C.  Strain,   O.  Farkas,  D.  K.  Malick,  A.  D.  Rabuck,  K.  Raghavachari,  J.  B.  Foresman,  J.  V.  Ortiz,  Q.   Cui,   A.   G.   Baboul,   S.   Clifford,   J.   Cioslowski,   B.   B.   Stefanov,   G.   Liu,   A.   Liashenko,   P.   Piskorz,  I.  Komaromi,  R.  L.  Martin,  D.  J.  Fox,  T.  Keith,  M.  A.  Al-­‐Laham,  C.  Y.  Peng,  A.   Nanayakkara,  M.  Challacombe,  P.  M.  W.  Gill,  B.  Johnson,  W.  Chen,  M.  W.  Wong,  C.   Gonzalez,  J.  A.  Pople,  Gaussian  03,  Revision  B.04,  Gaussian,  Inc.  Pittsburgh  PA,  2003.       Chapter  IV   1. (a)  K.  Kikuchi,  Chem.  Soc.  Rev.,  2010,  39,  2048-­‐2053.;  C.  N.  Carroll,  Chem.  Soc.  Rev.,   2010,  39,  3875-­‐3888.;    (b)  For  reviews  of  molecular  logic  see:  C.A.  Mirkin  and  M.  A.   Ratner,  Molecular  Electronics  Annual  Reviews,  Inc.;  1992,  43.;    B.  L.  Feringa,   Molecular  Switches,  Wiley-­‐VCH  GmbH,  Weinheim,  Germany,  2001.  (c)  A.  G.   Montalban,  S.  M.  Baum,  A.  G.  M.  Barrett  and  B.  M.  Hoffman,  Dalton.  Trans.,  2003,   2093-­‐2102.;  O.-­‐  J.  Norum,  P.  K.  Selbo,  A.  Weyergang,  K.-­‐  E.  Giercksky  and  K.  Berg,  J.   Photochem.  Photobiol.  B,  2009,  96,  83-­‐92.     197     2. (a)  P.  A.  Gale  and  T.  Gunnlaugsson,  Chem.  Soc.  Rev.,  2010,  39,  3595-­‐3596.  (b)  B.   Valeur,  Molecular  Fluorescence,  Wiley-­‐VCH  Verlag  GmbH,  Weinheim,  Germany,  2002,   273-­‐350.     3. (a)  L.  Fabbrizzi,  F.  Gatti,  P.  Pallavicini,  and  L.  Parodi,  New  J.  Chem.,  1998,  1403.  (b)  H.   Shizuka,  and  S.  Tobita,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1982,  104,  6919.  (c)  J.  H.  Clements,  S.  E.   Webber,  Macromolecules,  2004,  37,  1531.  (d)  A.  P.  de  Silva,  H.  Q.  Nimal  Gunaratne,   C.  P.  McCoy,  Chem.  Commun.,  1996,  21,  2399.     4. (a)  G.  De  Santis,  L.  Fabrizzi,  M.  Licchelli,  A.  Poggi,  and  A.  Taglietti,  Angew.  Chem.  Int.   Ed.  Engl.,  1996,  35,  202.  (b)  T.  Gunnlaugsson,  A.  P.  Davis,  J.  E.  O’Brien,  and  M.  Glynn,   Org.  Biomol.  Chem.,  2005,  3,  48.  (c)  S.  E.  Garcîa-­‐Garrido,  C.  Caltagirone,  M.  E.  Light,  P.   A.  Gale,  Chem.  Commun.,  2007,  1450.   5. (a)  S.  J.  Dickson,  A.  N.  Swinburne,  M.  J.  Paterson,  G.  O.  Lloyd,  A.  Beeby  and  J.  W.   Steed,  Eur.  J.  Inorg.  Chem.,  2009,  3879-­‐3882.  (b)  A.  Roque,  F.  Pina,  S.  Alves,  R.   Ballardini,  M.  Maestri  and  V.  Balzani,  J.  Mater.  Chem.,  1999,  9,  2265.     6. C.  N.  Carroll,  O.  B.  Berryman,  C.  A.  Johnson  II,  M.  M.  Haley,  and  D.  W.  Johnson,  Chem.   Commun.,  2009,  2520.     7. J.  M.  Heemstra  and  J.  S.  Moore,  Org.  Lett.,  2004,  6,  659-­‐662.     8.  M.  J.  Frisch,  et  al.  Gaussian  03,  Revision  B.04,  Gaussian,  Inc.  Pittsburgh  PA,  2003.  Full   reference  in  ESI.;  Spartan  08,  Wavefunction,  Inc.,  Irvine,  CA,  USA.     9.  (a)  B.  Valeur  in  Molecular  Fluorescence,  Wiley-­‐VCH:  Weinheim,  2002,  72-­‐123.  (b)  J.  R.   Lakowicz  in  Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy,  Springer,  2006.     10.  (a)  J.  H.  Clements  and  S.  E.  Webber,  Macromolecules,  2004,  37,  1531-­‐1536.  (b)  J.   Duhamel,  Macromolecules,  2004,  37,  1987-­‐1989.     11.  (a)  K.  W.  Allen,  E.  S.  Cockburn,  R.  S.  Davidson,  K.  S.  Tranter  and  H.  S.  Zhang,  Pure  &   Appl.  Chem.,  1992,  64,  1225-­‐1230.  (b)    T.  Handa,  Y.  Utena  and  H.  Yajima,  J.  Phys.   Chem.,  1984,  88,  5150-­‐5154.     12.  (a)  C.  A.  Crutchfield  and  D.  J.  Harris,  J.  Magnetic  Resonance,  2007,  185,  179-­‐182.  (b)   Y.  Cohen,  L.  Avram  and  L.  Frish,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.,  2005,  44,  520-­‐554.     198     13.  (a)  A.  A.  Marti,  X.  Li,  S.  Jockusch,  Z.  Li,  B.  Raveendra,  S.  Kalachikov,  J.  J.  Russo,  I.   Morozova,  S.  V.  Puthanveettil,  J.  Ju  and  N.  J.  Turro,  Nucl.  Acids  Res.,  2006,  34,  3161-­‐ 3168.  (b)  J.  B.  Birks,  D.  J.  Dyson  and  I.  H.  Munro,  Proc.  Royal  Soc.  London  A,  1963,  275,   575-­‐588.       Chapter  V   1. (a)  J.  T.  Davis,  O.  Okunola  and  R.  Quesada,  Chem.  Soc.  Rev.,  2010,  39,  3843-­‐3862.  (b)     R.  G.  Deeley,  C.  Westlake  and  S.  P.  C.  Cole,  Physiol.  Rev.,  2006,  86,  849-­‐899.  (c)  J.   Mareda  and  S.  Matile,  Chem.  Eur.  J.,  2008,  15,  28-­‐37.     2. (a)  K.  Renkawek  and  G.  J.  Bosman,  NeuroReport,  1995,  6,  929.  (b)  M.  P.  Anderson,  R.   J.  Gregory,  S.  Thompson,  D.  W.  Souza,  S.  Paul,  R.  C.  Mulligan,  A.  E.  Smith  and  M.  J.   Welsh,  Science,  1991,  253,  202.     3. (a)  C.  E.  Johanson,  S.  M.  Sweeney,  J.  T.  Parmelee  and  M.  H.  Epstein,  Am.  J.  Physiol.   Cell  Physiol.,  1990,  258,  C211-­‐C256.  (b)  R.  D.  Egleton,  C.  C.  Campos,  J.  D.  Huber,  R.  C.   Brown  and  T.  P.  Davis,  Diabetes,  2003,  52,  1496-­‐1501.     4. (a)  T.  J.  Jentsch,  V.  Stein,  F.  Weinreich  and  A.  A.  Zdebik,  Physiol.  Rev.,  2002,  82,  503-­‐ 568.  (b)  C.  Kubisch,  T.  Schmidt-­‐Rose,  B.  Fontaine,  A.  H.  Bretag  and  T.  J.  Jentsch,  Hum.   Mol.  Genet.,  1998,  7,  1753-­‐1760.     5. J.  O.  Lundberg  et  al.,  Nature  Chem.  Biol.,  2009,  5,  865-­‐869.     6. (a)  N.  S.  Bryan  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  2007,  104,  19144-­‐19149.  (b)  U.  Hink  et  al.,   Circulation  Research,  2001,  88,  e14-­‐e22.     7. C.  Chang,  Nature  ,2007,  448,  654-­‐655  and  references  therein.     8. J.  A.  Prescher  and  C.  R.  Bertozzi,  Nature  Chem.  Biol.,  2005,  1,  13-­‐21.     9.  I.  Chen  and  A.  Y.  Ting,  Curr.  Opin.  Biotechnol.,  2005,  16,  35-­‐40.     199     10.  (a)  S.  L.  R.  Barker,  B.  A  Thorsrud  and  R.  Kopelman,  Anal.  Chem.,  1998,  70,  100-­‐104.   (b)  M.  Hara-­‐Chikuma,  B.  Yang,  N.D.  Sonawane,  S.  Sasaki,  S.  Uchida  and  A.  S.  Verkman,   J.  Biol.  Chem.,  2005,  280,  1241.  (c)  E.  B.  Veale,  D.  O.  Frimannsson,  M.  Lawler  and  T.   Gunnlaugsson,  Org.  Lett.,  2009,  11,  4040.     11.  C.  E.  J.  Haynes  and  P.  A.  Gale,  Chem.  Commun.,  2011,  47,  8203-­‐8209.     12.  H.  Matsumura,  M.  Iwamoto  and  K.  Furusawa,  Bull.  Chem.  Soc.  Jpn.,  1986,  59,  1533-­‐ 1537.   13.  (a)  Y.  Hong,  J.  W.  Y.  Lam  and  B.  Z.  Tang,  Chem.  Commun.,  2009,  4332-­‐4353.  (b)  Y.   Hong,  J.  W.  Y.  Lam  and  B.  Z.  Tang,  Chem.  Soc.  Rev..,  DOI:  10.1039/CICSI5113D.  (c)  C.   Zhu,  S.  Pang,  J.  Xu,  L.  Jia,  F.  Xu,  J.  Mei,  A.  Qin,  J.  Sun,  J.  Ji  and  B.  Tang,  Analyst,  2011,   136,  3343.     14.  J.  B.  Birks  in  Photophysics  of  Aromatic  Molecules,  Wiley-­‐VCH:  London,  1970.     15.  S.  Doose,  H.  Neuweiler  and  M.  Sauer,  Chem.  Phys.  Chem.,  2009,  10,  1389-­‐1398.     16.  (a)  N.  J.  Greenfield,  Anal.  Biochem.,  1996,  235,  1-­‐10.  (b)  P.  Jonkheijm,  F.  J.  M.   Hoeben,  R.  Kleppinger,  J.  van  Herrikhuyzen,  A.  P.  H.  J.  Schenning  and  E.  W.  Meijer,  J.   Am.  Chem.  Soc.,  2003,  125,  15941-­‐15949.