PHENOTYPTIC  PLASTICITY  IN  LARVAL  AND  JUVENILE  MARINE  INVERTEBRATES:  EFFECTS  OF  PREDATORS,  FOOD,  GRAVITY,  AND  SUNLIGHT                          by    JENNA  ROSE  VALLEY                          A  DISSERTATION    Presented  to  the  Department  of  Biology  and  the  Graduate  School  of  the  University  of  Oregon  in  partial  fulfillment  of  the  requirements  for  the  degree  of    Doctor  of  Philosophy    September  2016     ii   DISSERTATION  APPROVAL  PAGE    Student:  Jenna  Rose  Valley    Title:  Phenotypic  Plasticity  in  larval  and  juvenile  marine  invertebrates:  Effects  of  predators,  food,  gravity,  and  sunlight      This  dissertation  has  been  accepted  and  approved  in  partial  fulfillment  of  the  requirements  for  the  Doctor  of  Philosophy  degree  in  the  Department  of  Biology  by:    Barbary  (Bitty)  Roy       Chair  Richard  Emlet         Advisor  Alan  Shanks         Core  Member  Kelly  Sutherland       Core  Member  William  Orr         Institutional  Representative    and    Scott  L.  Pratt         Dean  of  the  Graduate  School    Original  approval  signatures  are  on  file  with  the  University  of  Oregon  Graduate  School.    Degree  awarded  September  2016. iii                                    ©  2016  Jenna  Rose  Valley  This  work  is  licensed  under  a  Creative  Commons   Attribution-­‐NonCommercial-­‐NoDerivs  (United  States)  License.     iv   DISSERTATION  ABSTRACT    Jenna  Rose  Valley    Doctor  of  Philosophy    Department  of  Biology    September  2016    Title:  Phenotypic  plasticity  in  larval  and  juvenile  marine  invertebrates:  Effects  of  predators,  food,  gravity,  and  sunlight         Phenotypic  plasticity,  the  ability  of  a  single  genotype  to  be  expressed  as  a  range  of  phenotypes  in  response  to  environmental  variation,  is  a  widespread  phenomenon.  Documented  increasingly  among  the  larval  stages  of  marine  organisms,  phenotypic  plasticity  in  the  veliger  larvae  of  the  marine  snail  Littorina  scutulata  was  investigated  in  response  to  predatory,  nutritional,  and  gravitational  stimuli.       Veligers  developed  rounder  shells,  smaller  apertures,  and  reinforced  aperture  margins  in  response  to  water-­‐borne  cues  from  predatory  crab  larvae.  The  nature  and  degree  of  the  induced-­‐morphologies  depended  on  cue  composition  and  conferred  decreased  vulnerability  to  predation.       Food-­‐limited  veligers  developed  larger  feeding  and  swimming  structures  (vela)  with  longer  cilia  relative  to  shell  size  compared  to  larvae  raised  with  high  food.  This  inducible  offense  corresponded  with  a  decrease  in  vertical  swimming  speed,  an  unexpected  result  possibly  reflecting  behavioral  manipulation  of  individual  velar  components.  A  cell  proliferation  assay  indicated  that  growth  of  the  larger  structure  was  achieved  partially  by  a  steady  rate  of  cell  division  over  a  longer  period  of  time;  an  initially  higher  level  of  cell  proliferation  in  veligers  raised  on  high  food  dropped  off  sharply.     Velar  lobe  asymmetry,  where  one  lobe  is  larger  than  the  other,  may  exist  to  offset  an  asymmetry  in  weight  distribution  due  to  how  the  larval  shell  is  carried.  The  larger  velar v    lobe  overlies  the  protruding  spire  of  the  larval  shell.  Bi-­‐  and  multi-­‐lobed  vela  get  bigger  with  shell  size  but  follow  different  rules  with  regards  to  the  relationship  between  velar  asymmetry  and  shell  asymmetry.  Experimental  alternations  of  mass  distribution  of  the  larval  shell  caused  changes  in  the  ratio  of  area  between  each  side  of  the  velum  and  total  velar  growth  for  larvae  of  L.  scutulata.       Following  settlement  and  metamorphosis,  juveniles  of  intertidal  marine  invertebrates  are  subject  to  additional  stressors  that  can  manifest  as  phenotypic  variation.  Color  differences  between  juvenile  and  adult  Strongylocentrotus  purpuratus  were  shown  to  be  caused  by  variation  in  light  exposure.  Green  juveniles  raised  in  sunlight  turned  purple  (due  to  more  pigment)  and  showed  decreased  susceptibility  to  artificial  UVR  than  urchins  kept  in  the  dark,  which  remained  green  (due  to  less  pigment).     This  dissertation  includes  previously  unpublished  co-­‐authored  material. vi   CURRICULUM  VITAE      NAME  OF  AUTHOR:  Jenna  Rose  Valley      GRADUATE  AND  UNDERGRADUATE  SCHOOLS  ATTENDED:       University  of  Oregon,  Eugene,  OR     Appalachian  State  University,  Boone,  NC     University  of  North  Carolina  at  Wilmington,  Wilmington,  NC      DEGREES  AWARDED:       Doctor  of  Philosophy,  Biology,  2016,  University  of  Oregon     Master  of  Science,  Biology,  2011,  Appalachian  State  University     Bachelor  of  Science,  2008,  University  of  North  Carolina  at  Wilmington      AREAS  OF  SPECIAL  INTEREST:       Phenotypic  plasticity     Larval  biology  and  ecology     Marine  biology      PROFESSIONAL  EXPERIENCE:       Graduate  Research  Fellow,  Department  of  Biology,  Oregon  Institute  of  Marine     Biology,  University  of  Oregon,  Eugene,  2011  –  2016       Graduate  Teaching  Fellow,  Department  of  Biology,  Oregon  Institute  of  Marine     Biology,  University  of  Oregon,  Eugene,  2011  –  2016       Administrative  Outreach  Coordinator,  Department  of  Biology,  Oregon  Institute  of     Marine  Biology,  University  of  Oregon,  Eugene,  2012  –  2013       Graduate  Research  Assistant,  Department  of  Biology,  Appalachian  State  University,     Boone,  NC,  2010  –  2011       Graduate  Teaching  Assistant,  Department  of  Biology,  Appalachian  State  University,     Boone,  NC,  2008  –  2010      GRANTS,  AWARDS,  AND  HONORS:       National  Academies  Education  Fellow  in  the  Life  Sciences,  2015 vii     Oregon  Society  of  Conchologists  Scholarship,  2014       Oregon  Society  of  Conchologists  Scholarship,  2013       Oregon  Sea  Grant  Neil  Richmond  Memorial  Fellowship,  2013       Inducted  into  the  Cratis  D.  Williams  Society,  Appalachian  State  University,  2011       Graduate  Teaching  Assistantship  Award  for  Introductory  Biology  –  Majors,     Appalachian  State  University,  2010       Graduate  Student  Association  Senate  Grant,  Appalachian  State  University,  2010       Office  of  Student  Research  Grant,  Appalachian  State  University,  2010       Office  of  Student  Research  Grant,  Appalachian  State  University,  2009       Charlotte  Mangum  Student  Support  Grant,  Society  for  Integrative  and  Comparative     Biology,  2009       Graduate  Student  Association  Senate  Travel  Grant,  Appalachian  State  University,     2009       Office  of  Student  Research  Travel  Grant,  Appalachian  State  University,  2009       Graduate  School  Provost  Fellowship,  Appalachian  State  University,  2009-­‐2010     Office  of  Student  Research  Grant,  Appalachian  State  University,  2008       Graduate  Student  Association  Senate  Grant,  Appalachian  State  University,  2008       Graduate  Student  Research  Grant,  Appalachian  State  University,  2008       Graduate  School  Alumni  Scholarship,  Appalachian  State  University,  2008-­‐2009       Summa  cum  laude,  University  of  North  Carolina  at  Wilmington,  2008      PUBLICATIONS:       Valley,  J.  and  T.  C.  Hiebert.  2015.  Littorina  plena.  In  Oregon  Estuarine     Invertebrates:  Rudys'  Illustrated  Guide  to  Common  Species,  3rd  ed.,  T.  C.     Hiebert,  B.  A.  Butler,  and  A.  L.  Shanks,  eds.  University  of  Oregon  Libraries     and  Oregon  Institute  of  Marine  Biology,  Charleston,  OR.     http://hdl.handle.net/1794/19870       Valley,  J.  and  T.  C.  Hiebert.  2015.  Littorina  scutulata.  In  Oregon  Estuarine           Invertebrates:  Rudys'  Illustrated  Guide  to  Common  Species,  3rd  ed.,  T.  C.         Hiebert,  B.  A.  Butler,  and  A.  L.  Shanks,  eds.  University  of  Oregon  Libraries     viii       and  Oregon  Institute  of  Marine  Biology,  Charleston,  OR.             http://hdl.handle.net/1794/19870       Valley,  J.  R.  2011.  Eye  development  in  the  box  jellyfish  Carybdea  marsupialis.  M.  S.     thesis,  Appalachian  State  University,  Boone,  NC.       ix   ACKNOWLEDGMENTS     This  work  and  degree  could  not  have  been  completed  without  the  guidance,  feedback,  and  support  provided  to  me  by  my  advisor,  Richard  Emlet,  and  committee  members  Bitty  Roy,  Bill  Orr,  Kelly  Sutherland,  and  Alan  Shanks.  I  am  also  very  grateful  to  Brian  Bingham  and  Samuel  Gerber  for  their  help  and  advice  with  statistical  analyses.  None  of  this  work  would  have  been  possible  without  the  moral  and  academic  supported  provided  to  my  by  all  of  the  OIMB  faculty  and  staff,  especially  Barbara  Butler  both  for  her  help  in  tracking  down  references  and  for  being  a  friendly  listening  ear.  Thank  you  to  Maya  Watts  for  being  such  a  supportive  mentor  and  commiserator.  The  graduate  student  community  here  also  provided  much  needed  support  and  distraction  –  I  am  very  grateful  to  Laurel  Hiebert  in  particular  for  becoming  a  wonderful  collaborator  and  to  both  her  and  Amy  Burgess  for  their  cherished  friendship.  Special  thanks  also  to  my  previous  and  current  labmates  Kira  Treibergs,  Rose  Rimler,  Ella  Lamont,  and  Mackenna  Hainey.  Also,  I  could  not  have  completed  this  degree  without  the  much-­‐appreciated  encouragement  from  my  friends  and  family:  Mom,  Dad,  Tess,  Ashley,  Sophie,  Gabby,  and  most  importantly,  Zac  –  thank  you.  Lastly,  I  am  very  grateful  to  the  veligers  and  urchins  used  in  the  completion  of  these  studies.  Although  I  have  always  loved  marine  biology,  my  time  at  OIMB  has  fostered  an  especially  strong  connection  with  and  appreciation  for  marine  invertebrates  and  their  larvae.     This  research  was  supported  in  part  by  NSF  grant  #1259603  to  R.  B.  Emlet,  A.  L.  Shanks,  and  D.  A.  Sutherland,  and  by  scholarships  from  the  Oregon  Society  of  Conchologists.  Thanks  also  to  Marley  Jarvis,  Gary  Cherr,  and  Joe  Newman  for  help  finding  and  procuring  materials,  to  Katie  Thomas  for  help  with  equipment,  and  to  Katie,  Cynthia  Tedore,  and  Sönke  Johnsen  for  advice  on  methods  for  the  work  in  Chapter  V.       x   TABLE  OF  CONTENTS  Chapter   Page      I.   INTRODUCTION    ......................................................................................................................................     1  II.   PREDATOR-­‐INDUCED  MORPHOLOGIES  AND  CUE  SPECIFICITY  IN  VELIGER          LARVAE  OF  LITTORINA  SCUTULATA    .................................................................................................     8     Introduction  .........................................................................................................................................     8     Materials  and  Methods  ...................................................................................................................     12     Predator  collection  and  rearing  ............................................................................................     12     Prey  adult  and  veliger  collection  ..........................................................................................     13     Experimental  set-­‐up  ...................................................................................................................     13     Predation  trials  ............................................................................................................................     14     Measurement  methods  .............................................................................................................     15     Statistical  methods  .....................................................................................................................     16     Results  ....................................................................................................................................................     17     Discussion  .............................................................................................................................................     21     Shell  plasticity  ...............................................................................................................................     21     Cue  considerations  .....................................................................................................................     25     Costs  and  trade-­‐offs  ...................................................................................................................     27     Future  considerations  ...............................................................................................................     28     Bridge  to  Chapter  III  ........................................................................................................................     28  III.     MORPHOLOGICAL  PLASTICITY  IN  RESPONSE  TO  VARIABLE  FOOD          CONCENTRATIONS  IN  VELIGERS  OF  LITTORINA  SCUTULATA  WITH  ANALYSES  OF          SWIMMING  SPEED  AND  VELAR  GROWTH  ...................................................................................     29     Introduction  .........................................................................................................................................     29     Materials  and  Methods  ...................................................................................................................     33     Adult  and  veliger  collection  ....................................................................................................     33     Study  set-­‐up  ...................................................................................................................................     33   xi   Chapter   Page         Velar  and  cilia  measurements  ...............................................................................................     34     BrdU  incubation  ...........................................................................................................................     35     BrdU  assay  and  antibody  labeling  .......................................................................................     36     Swimming  speed  measurements  .........................................................................................     38     Statistical  methods  .....................................................................................................................     39     Results  ....................................................................................................................................................     42     Velar  and  cilia  measurements  ...............................................................................................     43     Swimming  speed  .........................................................................................................................     47     Cell  proliferation  .........................................................................................................................     52     Discussion  .............................................................................................................................................     59     Velar  plasticity  ..............................................................................................................................     59     Larval  mortality  ...........................................................................................................................     59     Costs  and  trade-­‐offs  ...................................................................................................................     60     Veliger  swimming  speeds  ........................................................................................................     62   Sensation  of  food  environments  ...........................................................................................     65     Cell  division  and  velar  growth  ...............................................................................................     65     Future  considerations  ...............................................................................................................     67     Bridge  to  Chapter  IV  .........................................................................................................................     69  IV.   LIFE  IN  THE  BALANCE:  DISTRIBUTION  AND  DEVELOPMENT  OF  ASYMMETRIC          VELA  .............................................................................................................................................................     70     Introduction  .........................................................................................................................................     70     Materials  and  Methods  ...................................................................................................................     75     Natural  velar  asymmetry  in  Littorina  scutulata  ............................................................     75     Literature  review  of  velar  asymmetry  ...............................................................................     75     xii   Chapter   Page         Larval  collection,  rearing,  and  study  set-­‐up  ....................................................................     83     Attachment  of  beads  to  larval  shells  ...................................................................................     84     Velar  measurements  ..................................................................................................................     85     Veliger  and  bead  masses  ..........................................................................................................     85     Veliger  swimming  paths  ...........................................................................................................     87     Statistical  methods  .....................................................................................................................     87     Results  ....................................................................................................................................................     89     Discussion  .............................................................................................................................................     95     Literature  survey  of  velar  asymmetry  ...............................................................................     95     Experimental  manipulation  ....................................................................................................     98     Bridge  to  Chapter  V  ..........................................................................................................................     102  V.     SUNLIGHT  AND  COLORATION  IN  THE  PURPLE  URCHIN  STRONGYLOCENTROTUS          PURPURATUS  .............................................................................................................................................     103     Introduction  .........................................................................................................................................     103     Materials  and  Methods  ...................................................................................................................     111     Rearing  study  set-­‐up  ..................................................................................................................     111     Field-­‐collected  comparison  .....................................................................................................     113     Photography  and  color  analysis  ...........................................................................................     114     Urchin  test  and  spine  growth  .................................................................................................     115     UVR  susceptibility  .......................................................................................................................     116     Pigment  extraction  and  absorbance  measurements  –  rearing  study  ...................     118     Pigment  extraction  and  absorbance  measurements  –  tube  feet  ............................     119     Statistical  methods  .....................................................................................................................     120     Results  ....................................................................................................................................................     122   xiii   Chapter   Page         Color  analysis  ................................................................................................................................     122   Urchin  growth  ...............................................................................................................................     124     UVR  susceptibility  .......................................................................................................................     125     Pigment  levels  ...............................................................................................................................     129     Discussion  .............................................................................................................................................     131     Color  and  microhabitat  .............................................................................................................     132     Costs  and  trade-­‐offs  ...................................................................................................................     134     UVR  susceptibility  .......................................................................................................................     135     Environmental  cue  .....................................................................................................................     135     Functions  of  echinochrome  ....................................................................................................     137     Echinoids  and  flavonoids  –  a  common  ground  ..............................................................     138     Future  considerations  ...............................................................................................................     139  VI.   CONCLUSIONS  ...........................................................................................................................................     142  APPENDIX  .............................................................................................................................................................     144  REFERENCES  CITED  ........................................................................................................................................     145     xiv   LIST  OF  FIGURES  Figure   Page     2.1.  Cage  used  for  treatment  cues  and  shell  measurements  ..................................................     15     2.2.  Relationship  between  SAR  and  shell  height  for  veligers  from  the  three                treatments  ............................................................................................................................................     19       2.3.  Relationship  between  aperture  area  and  shell  height  for  veligers  from  the                    three  treatments  ...............................................................................................................................     20       2.4.  Relationship  between  marginal  reinforcement  and  shell  height  for  veligers                from  the  three  treatments  ............................................................................................................     20       2.5.  Survival  of  veligers  raised  in  the  presence  of  predators  consuming  conspecifics                and  veligers  from  a  control  environment  ...............................................................................     21       3.1.  Velar  and  cilia  measurements  .....................................................................................................     35       3.2.  Confocal  projection  of  BrdU-­‐labeled  nuclei  ..........................................................................     37       3.3.  Relationship  between  shell  size  and  age  for  veligers  raised  in  a  high  and  low                    food  environment  .............................................................................................................................     42       3.4.  Relationship  between  velar  size  and  age  for  veligers  raised  in  a  high  and  low                    food  environment  .............................................................................................................................     43       3.5.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  velar  circumference                  and  shell  length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ................     44       3.6.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  velar  circumference  and  shell                  length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ....................................     44       3.7.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  cilia  length  and  shell                  length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ....................................     46       3.8.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  cilia  length  and  shell  length  for                  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .........................................................     46       3.9.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  cilia  length  and  velar                    circumference  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ...................     48       3.10.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  cilia  length  and  velar                      circumference  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .................     48       3.11.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  swimming  speed                        and  shell  length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .............     50       xv   Figure   Page     3.12.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  swimming  speed  and  shell                    length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ................................     50       3.13.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  swimming  speed                    and  velar  circumference  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food                    environment  ....................................................................................................................................     51       3.14.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  swimming  speed  and  velar                        circumference  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .................     51       3.15.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  cell  proliferation                    and  shell  length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .............     53       3.16.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  cell  proliferation  and  shell                  length  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ................................     53       3.17.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  cell  proliferation                    and  velar  circumference  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food                    environment  ....................................................................................................................................     55       3.18.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  cell  proliferation  and  velar                        circumference  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .................     55       3.19.  Loess  smoothed  regressions  of  the  relationship  between  cell  proliferation                    and  age  for  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  ..............................     57       3.20.  Linear  regressions  of  the  relationship  between  cell  proliferation  and  age  for                  veligers  raised  in  a  high  and  low  food  environment  .......................................................     57       4.1.  Measurements  of  veligers  from  the  literature  .....................................................................     83       4.2.  Weighted  veligers  and  velar  measurements  ........................................................................     85       4.3.  Total  velar  area  and  total  shell  area  for  bi-­‐  and  multi-­‐lobed  veligers  .......................     90       4.4.  Velar  ratio  and  shell  ratio  for  bi-­‐  and  multi-­‐lobed  veligers  ............................................     91       4.5.  Velar  asymmetry  in  veligers  of  Littorina  scutulata  ............................................................     92       4.6.  Horizontal  swimming  paths  of  an  unweighted  and  weighted  veliger  .......................     93       4.7.  Velar  area  of  unweighted  and  weighted  veligers  ...............................................................     94       4.8.  Velar  ratio  of  unweighted  and  weighted  veligers  ...............................................................     95       5.1.  Green  and  purple  juveniles  and  their  respective  habitats  ..............................................     104       5.2.  Green  and  purple  juveniles  and  the  difference  in  podia  color  ......................................     111   xvi   Figure   Page     5.3.  Rearing  study  set-­‐up  and  color  analysis  .................................................................................     113     5.4.  Growth  and  UVR  susceptibility  tube  foot  assay  ..................................................................     116       5.5.  UVR  susceptibility  righting  time  assay  ....................................................................................     118       5.6.  Color  of  urchins  raised  in  sunlight,  in  filtered  sunlight,  and  in  the  dark  ..................     123       5.7.  Change  in  color  over  time  of  urchins  raised  in  sunlight,  in  filtered  sunlight,  and                  in  the  dark  and  compared  to  field-­‐collected  juveniles  .....................................................     124       5.8.  Test  and  spine  growth  of  urchins  raised  in  sunlight,  in  filtered  sunlight,  and  in                    the  dark  ................................................................................................................................................     125       5.9.  Righting  time  prior  to  and  following  exposure  to  UVR  for  urchins  raised  in                  sunlight,  in  filtered  sunlight,  and  in  the  dark  ........................................................................     126       5.10.  Tube  foot  extension  prior  to  and  following  exposure  to  UVR  for  urchins                    raised  in  sunlight,  in  filtered  sunlight,  and  in  the  dark  .................................................     127       5.11.  Righting  time  prior  to  and  following  exposure  to  UVR  for  field-­‐collected                    green  and  purple  juveniles  ........................................................................................................     128       5.12.  Tube  foot  extension  prior  to  and  following  exposure  to  UVR  for                    field-­‐collected  green  and  purple  juveniles  .........................................................................     128       5.13.  Absorption  spectrum  of  dermally-­‐extracted  pigment  ...................................................     129       5.14.  Absorbance  for  dermal  extractions  from  urchins  raised  in  sunlight,  in  filtered                    sunlight,  and  in  the  dark  and  compared  to  field-­‐collected  ecotypes  .......................     130       5.15.  Absorbance  for  dermal  extractions  of  tube  feet  from  the  aboral  and  oral                    sides  of  field-­‐collected  green  and  purple  ecotypes  .........................................................     132       S4.1.  Sinking  rates  of  veligers  of  L.  scutulata  ................................................................................     144         xvii   LIST  OF  TABLES  Table   Page     2.1.  Summary  of  statistical  results  (SAR,  aperture  area,  marginal  reinforcement)  .....     18       2.2.  Summary  of  results  of  Vaughn  (2007)  and  the  present  study  ......................................     18       3.1.  Linear  regression  models  performed,  goodness  of  fit,  and  treatment  effects  .......     40       3.2  Comparisons  between  high  and  low  food  treatments  .......................................................     40       4.1.  Literature  measurements  .............................................................................................................     76       4.2.  Literature  measurements  of  shell  and  velar  area  for  scaled  veligers  ........................     80       4.3.  Regression  equations  and  statistics  .........................................................................................     89        1   CHAPTER  I      INTRODUCTION     The  relationship  between  organism  and  environment  is  most  often  thought  of  in  the  context  of  natural  selection,  whereby  individuals  with  traits  that  increase  fitness  in  an  environmental  setting  (such  as  having  a  thicker  coat  in  a  cold  climate)  are  more  likely  to  survive  and  pass  these  favorable  traits  onto  their  offspring  by  genetic  inheritance.  In  this  context,  the  expression  of  a  phenotypic  trait  is  determined  solely  by  an  organism’s  genetic  make-­‐up  and  the  environment  simply  provides  the  framework  within  which  the  adaptive  qualities  of  the  trait  are  assessed  via  natural  selection.  Evolutionary  change  by  natural  selection  is  based  around  variation  between  individuals  or  even  between  populations  or  species  whereby  a  trait  evolves  to  be  better  adapted  to  an  environment  over  multiple  generations  (between-­‐generation  variation).  However,  the  temporal  scale  of  environmental  variation  often  outpaces  the  rate  of  genetic  change.  While  a  trait  may  have  evolved  in  response  to  a  particular  set  of  environmental  conditions,  changes  in  these  environmental  conditions  may  disrupt  that  match,  thereby  reducing  fitness.  In  this  situation  it  is  beneficial  for  an  organism  to  be  able  to  adjust  its  phenotype  during  its  lifetime  in  response  to  its  surroundings  (within-­‐generation  variation).     This  ability,  environmentally-­‐dependent  ‘intra-­‐individual’  variation,  is  referred  to  as  phenotypic  plasticity  and  encompasses  changes  in  behavior,  physiology,  morphology,  or  life  history  of  an  organism  (e.g.,  Schlichting  and  Pigliucci,  1998;  Pigliucci,  2001;  West-­‐Eberhard,  2003;  Whitman  and  Agrawal,  2009,  Kelly  et  al.,  2012).  In  other  words,  one  genotype  (the  individual)  is  capable  of  producing  a  range  of  phenotypes  reflective  of  environmental  variation.  This  phenotypic  range  (representing  the  relationship  between  environmental  and  phenotypic  variation  of  a  trait)  is  referred  to  as  a  reaction  norm,  a  term  coined  by  Woltereck  (1909  –  as  cited  by  Gottlieb,  2003)  in  describing  the  development  of  ‘helmets’  in  freshwater    2   crustaceans  in  response  to  varying  food  levels.  Environmentally-­‐influenced  traits  are  referred  to  as  ‘plastic’  whereas  traits  that  are  produced  irrespective  of  external  environmental  variation  are  said  to  be  ‘fixed’,  ‘canalized’,  or  ‘constitutive’  (e.g.,  Pigliucci  et   al.,  2006)       Whether  a  trait  is  constitutive  or  plastic  heavily  depends  on  the  nature  of  the  environmental  heterogeneity,  specifically  the  relationship  between  the  spatial  and  temporal  ‘grain’  of  variation  (e.g.,  Berrigan  and  Scheiner,  2004;  Hollander,  2008;  Scheiner,  2013;  Hollander  et  al.,  2014).  If  the  scale  of  spatial  or  temporal  variation  is  large  (coarse-­‐grained),  exceeding  a  species’  dispersal  potential  or  lifespan,  it  is  most  beneficial  for  a  population  to  evolve  a  fixed  adaptation  to  the  local  set  of  conditions.  Alternatively,  spatial  or  temporal  variation  that  is  too  fine-­‐grained  (conditions  vary  over  a  much  smaller  area  or  duration)  may  also  favor  a  fixed  phenotype,  a  generalist  that  is  only  intermediately  matched  to  each  set  of  conditions  but  exhibits  higher  fitness  overall  (a  jack-­‐of-­‐all-­‐trades,  master  of  none).  Plasticity  should  be  favored  only  when  an  organism  can  change  quickly  relative  to  the  scale  of  environmental  change,  otherwise  it  may  be  constantly  lagging  behind  –  this  is  especially  relevant  for  morphological  plasticities  that  require  more  time  to  change  as  opposed  to  physiological  or  behavioral  changes  (e.g.,  Padilla  and  Adolph,  1996;  Whitman  and  Agrawal,  2009).  It  is  also  important  to  remember  that  plasticity  and  its  attributes  (e.g.,  reactions  norms  and  underlying  genetic  variability)  are  themselves  traits  subject  to  natural  selection,  heritability,  or  canalization  (e.g.,  Schlichting  and  Pigliucci,  1995,  1998;  Pigliucci  et  al.,  2006;  Whitman  and  Agrawal,  2009).       The  value  of  phenotypic  plasticity  relies  on  the  translation  of  environmental  variation  into  the  appropriate  phenotypic  response.  The  environmental  stimulus  (e.g.,  temperature,  nutrition,  light)  for  the  production  of  altered  phenotypes  needs  to  be  a  reliable  indicator  and,  to  some  degree,  predictor  of  an  organism’s  surroundings  (e.g.,  Reed  et  al.,    3   2010;  Scheiner  and  Holt,  2012).  One  of  the  most  well-­‐studied  areas  of  phenotypic  plasticity  surrounds  the  relationship  between  predators  and  prey,  such  as  the  ability  of  an  individual  to  respond  to  the  threat  of  predation  (e.g.,  chemical  cues  from  the  predator,  from  damaged  conspecific  prey,  or  from  a  combination  of  the  two)  via  a  change  in  behavior  or  morphology  that  confers  decreased  susceptibility  (e.g.,  Tollrian  and  Harvell,  1999).  For  example,  chemical  cues  from  a  nudibranch  predator  induce  the  formation  of  spines  in  colonies  of  a  marine  bryozoan  (Harvell,  1986).  In  another  instance,  a  species  of  freshwater  cladoceran  produces  increased  spine  and  body  length  in  response  to  elevations  in  temperature  but  not  to  cues  from  predatory  fish;  in  this  case,  predator  cues  are  an  unreliable  indicator  of  predation  risk  because  the  fish  are  always  present  but  predation  risk  increases  over  the  summer  months  as  juvenile  fish  grow  in  size  –  therefore,  temperature  is  a  reliable  proxy  of  predation  risk  (Miehls  et  al.,  2013).  Inducible  defenses  can  extend  beyond  threats  of  predation;  for  example,  the  ability  to  enhance  melanin  production  in  response  to  sun  exposure  is  an  inducible  defense  against  subsequent  damage  by  ultraviolet  radiation  (e.g.,  Friedmann  and  Gilchrest,  1987;  Miyamura  et  al.,  2006).  Alternative  to  these  ‘inducible  defenses’  are  ‘inducible  offenses’,  plastic  traits  enacted  by  consumers  that  confer  an  increased  acquisition  of  resources  (Padilla,  2001).         In  order  to  merit  a  phenotype  being  expressed  plastically  as  opposed  to  constitutively,  theory  dictates  there  should  also  be  a  trade-­‐off  in  costs  and  benefits  (e.g.,  Callahan  et  al.,  2008).  The  most  common  type  of  cost  cited  with  regards  to  inducible  traits,  such  as  an  inducible  defense,  is  the  existence  of  some  sort  of  direct  or  indirect  trade-­‐off  associated  with  the  defense  (e.g.,  allocation  costs  resulting  in  a  reduction  in  growth  rate  or  reproductive  output).  Net  fitness  should  increase  when  the  trait  is  expressed  in  the  appropriate  environment  (in  the  presence  of  a  predatory  threat)  but  decreases  when  the  trait  is  expressed  in  an  inappropriate  environment  (in  the  absence  of  predation).  For    4   example,  predator-­‐induced  thickening  of  snail  shells  often  co-­‐occurs  with  reduced  somatic  growth  (e.g.,  see  Brookes  and  Rochette,  2007).       The  normalcy  of  environmental  variation  begets  a  ubiquity  of  phenotypic  plasticity.  The  environment  of  many  marine  ecosystems  is  particularly  variable  with  temporal  and  spatial  heterogeneity  of  factors  such  as  nutrients,  temperature,  salinity,  light,  predators,  and  hydrodynamics.  Many  marine  organisms,  such  as  intertidal  invertebrates  with  indirect  lifecycles,  spend  at  least  a  portion  of  their  ontogeny  suspended  in  the  water  column  and  are  subject  to  the  influences  of  these  parameters  on  their  growth  and  development  (e.g.,  Thorson,  1950;  Young  and  Chia,  1985;  Rumrill,  1990;  Hoegh-­‐Guldberg,  1995;  Vaughn  and  Allen,  2010).  Following  settlement  and  metamorphosis  into  a  benthic  habitat,  the  organism  remains  subject  to  many  of  the  same  stressors  but  with  added  complications  that  come  with  an  intertidal  lifestyle  (e.g.,  risk  of  desiccation  and  more  extreme  fluctuations  in  sun  exposure,  temperature,  and  wave  action;  Helmuth  and  Hofmann,  2001;  Tomanek  and  Helmuth,  2002).       The  subsequent  three  chapters  of  this  dissertation  encompass  case-­‐studies  of  plasticity  in  the  larval  stage  of  a  local  marine  snail,  Littorina  scutulata,  in  response  to  three  very  different  but  important  environmental  variables:  predators,  food,  and  gravity.  The  fifth  chapter  provides  an  additional  example  of  an  inducible  trait  (in  response  to  sun  exposure)  but  in  post-­‐settlement  juveniles  of  another  intertidal  invertebrate,  Strongylocentrotus   purpuratus  (Stimpson,  1857),  a  local  urchin  species.  All  chapters  were  written  as  independently  publishable  units  and  should  be  referred  to  for  additional  pertinent  background  information.     Littorina  scutulata  (Gould,  1849)  is  a  marine  snail  with  planktotrophic  development,  meaning  that  the  planktonic  larvae  need  to  feed  on  phytoplankton  in  order  to  develop  to  the  point  at  which  they  can  settle  and  metamorphose  into  juveniles  (e.g.,  Thorson,  1950;    5   Strathmann,  1985).  Adult  L.  scutulata  can  be  found  in  the  high  intertidal  and  splash  zone  of  rocky  coast  habitats  (Hohenlohe,  2002,  2003)  and  release  pelagic  egg  capsules  containing  varying  numbers  of  embryos  from  early  April  to  early  October  (Strathmann,  1987a;  Hohenlohe,  2002).  After  approximately  nine  days  at  12-­‐14°C,  these  embryos  hatch  into  swimming  larvae  called  veligers,  superficially  resembling  miniature  snails  (Buckland-­‐Nicks   et  al.,  1973;  Hohenlohe,  2002).  Veliger  larvae,  found  in  gastropod  and  bivalve  mollusks,  are  named  for  the  ciliated  structure  called  a  velum  that  is  used  to  both  swim  and  feed  (Garstang,  1966;  Strathmann,  1987b).       While  examples  of  phenotypic  plasticity  are  well-­‐known,  especially  in  the  context  of  predator-­‐prey  interactions,  the  evidence  of  inducible  morphological  defenses  is  scarce  in  marine  larvae.  Chapter  II  of  this  dissertation  is  entitled  “Predator-­‐induced  morphologies  and  cue  specificity  in  veliger  larvae  of  Littorina  scutulata”  and  is  co-­‐authored  with  Richard  Emlet.  In  order  to  better  understand  morphological  plasticity  in  the  larvae  of  the  gastropod   Littorina  scutulata,  we  exposed  veligers  to  predatory  zoeae  of  Hemigrapsus  nudus.  The  treatments  included  growing  veliger  larvae  in  the  presence  of  predators  and  growing  veliger  larvae  in  the  presence  of  predators  consuming  conspecific  veliger  larvae.  The  larvae  were  then  evaluated  for  the  presence  of  defensive  morphologies  including  changes  in  shell  shape,  aperture  area,  and  reinforcement  of  aperture  margins.  Control  veligers  and  those  that  had  been  raised  in  the  presence  of  predators  consuming  conspecific  veliger  larvae  were  directly  paired  with  predators  to  compare  vulnerability  to  predation.       Chapter  III,  “Morphological  plasticity  in  response  to  variable  food  concentrations  in  veligers  of  Littorina  scutulata  with  analyses  of  swimming  speed  and  velar  growth”  explores  the  development  of  a  phenotypically  plastic  response  that  confers  a  greater  acquisition  of  resources  (such  as  the  change  in  size  of  a  feeding  structure),  called  an  inducible  offense,  and  its  effect  on  swimming  performance.  Veligers  of  Littorina  scutulata  raised  in  either  high  or    6   low  food  conditions  were  measured  for  changes  in  velar  size  and  prototrochal  cilia  length,  differences  in  vertical  swimming  speed,  and  velum-­‐specific  proliferative  activity  over  development.       The  ability  to  orient  in  relation  to  gravity  is  an  important  component  of  planktonic  life  for  the  larvae  of  many  marine  invertebrates,  including  gastropod  veligers.  The  helically-­‐coiled  shells  of  veligers  are  carried  in  such  a  way  that  the  proportion  of  weight  distributed  under  each  velar  lobe  is  unequal.  There  is  often  a  corresponding  asymmetry  between  the  two  sides  of  the  velum,  with  the  larger  side  overlying  the  protruding  spire  of  the  shell.    Chapter  IV,  “Life  in  the  balance:  distribution  and  development  of  asymmetric  vela”,  explores  the  prevalence  of  this  phenomenon  and  its  potential  as  a  plastic  trait  subject  to  manipulation.  I  investigated  the  relationship  between  asymmetries  in  weight  distribution  and  the  relative  sizes  of  overlying  velar  lobes  as  well  as  the  relationship  of  total  shell  area  vs.  total  velar  area  by  measuring  these  attributes  from  veliger  figures  or  photos  in  the  literature.  To  test  the  plasticity  of  velar  growth  and  velar  symmetry,  artificial  weights  were  attached  to  the  shells  of  veligers  of  Littorina  scutulata  and  results  were  interpreted  in  the  context  of  literature  findings.     The  purple  sea  urchin,  Strongylocentrotus  purpuratus,  is  a  local  urchin  commonly  found  in  the  mid-­‐  to  lower  intertidal  of  rocky  shores  exposed  to  moderate  to  strong  wave  action  (Durham  et  al.,  1980;  Pearse  and  Mooi,  2007).  Like  Littorina  scutulata,  S.  purpuratus  exhibits  indirect  development  with  a  pelagic  larval  stage.  Although  this  species  is  known  for  its  purple  color,  newly-­‐settled  individuals  and  juveniles  are  often  green  in  color  and  are  found  under  rocks  adjacent  to  exposed  urchin  beds  where  purple  juveniles  are  found.  Chapter  V  is  titled  “Sunlight  and  coloration  in  the  purple  urchin  Strongylocentrotus   purpuratus”  and  represents  work  done  in  collaboration  with  Laurel  Hiebert  and  Bailey  Counts.  In  this  chapter,  plasticity  is  explored  in  the  context  of  color  variation  and  function:    7   many  marine  invertebrates  display  intrapopulation  variation  in  coloration.  Based  on  the  habitats  in  which  the  two  ecotypes  can  be  respectively  found,  we  hypothesized  that  light  exposure,  and  specifically  ultraviolet  radiation  (UVR),  may  explain  the  color  variation  in  juvenile  urchins  and  that  pigment  production  is  a  phenotypically-­‐plastic  response,  presumably  for  photoprotection.  While  UVR  and  its  damaging  effects  have  been  studied  in  echinoderms,  most  studies  have  focused  on  embryonic  and  larval  stages.  To  test  the  role  of  sunlight  in  urchin  coloration,  field-­‐collected  green  juvenile  S.  purpuratus  were  raised  under  ambient  sunlight,  UVR-­‐filtered  sunlight,  or  in  darkness  for  over  100  days.  Pigment  production  was  monitored  over  time  via  photographic  assessment  of  color  and  at  the  end  of  the  study  by  spectrophotometric  measurement  of  dermally-­‐extracted  pigment  levels.  Photoprotective  properties  of  the  pigment  were  also  evaluated  at  the  end  of  the  study  by  exposure  to  artificial  UVR.    8   CHAPTER  II  PREDATOR-­‐INDUCED  MORPHOLOGIES  AND  CUE  SPECIFICITY  IN    VELIGER  LARVAE  OF  LITTORINA  SCUTULATA    All  work  in  this  chapter  was  planned,  implemented,  and  analyzed  by  the  author.  The  written  material  is  co-­‐authored  by  Richard  Emlet.     INTRODUCTION     Many  environmental  stimuli  induce  phenotypic  responses  such  as  those  resulting  from  competitors  (e.g.,  Relyea,  2002;  Relyea  and  Auld,  2005;  Todd,  2008),  conspecific  density  (e.g.,  Kemp  and  Bertness,  1984),  nutrition  (e.g.,  Strathmann  et  al.,  1993;  Walls  et  al.,  1993),  light  (e.g.,  Sultan,  2000;  Todd,  2008),  temperature  (e.g.,  Stelzer,  2002;  Atkinson  et  al.,  2003),  wave  exposure/water  flow  (e.g.,  Trussell,  1997;  Marchinko,  2003;  Todd,  2008),  etc.  Studies  on  predator  prey  interactions  abound  with  examples  of  phenotypic  plasticity  where  predatory  cues  such  as  chemical,  visual,  auditory,  or  mechanical  stimuli  are  capable  of  inducing  behavioral,  morphological,  physiological,  and  life  history  changes  in  prey  that  are  otherwise  not  displayed  and  which  often  result  in  decreased  vulnerability  to  predation  (Harvell,  1990;  Lima  and  Dill,  1990;  Kats  and  Dill,  1998;  Tollrian  and  Harvell,  1999;  Lass  and  Spaak,  2003;  Bernard,  2004;  Ferrari  et  al.,  2010;  Miner  et  al.,  2010;  Rundle  et  al.,  2011).  Tollrian  and  Harvell  (1999)  outline  the  requisite  conditions  for  the  evolution  of  an  inducible  (as  opposed  to  constitutive)  defense:  exposure  to  the  response-­‐inducing  cue  needs  to  be  variable,  the  cue  must  be  a  reliable  indication  of  danger,  the  induced  phenotype  must  be  effective  in  lessening  predation  risk,  and  there  should  be  a  trade-­‐off  in  costs  and  benefits  of  the  response  that  warrants  conditional  implementation.      9     Predator-­‐induced  phenotypic  plasticity  in  freshwater  planktonic  environments  is  well  known  with  behavioral  and  morphological  responses  demonstrated  in  algae,  rotifers,  ciliates,  and  crustaceans  (for  reviews  see  Kats  and  Dill,  1998;  Tollrian  and  Harvell,  1999;  Lass  and  Spaak,  2003).  Examples  of  predator-­‐induced  plasticities  in  a  marine  planktonic  environment  are  scarce  with  limited  examples  including  behavioral  responses  in  crustaceans  (e.g.,  Bollens  and  Frost,  1989;  Neill,  1990;  Bollens  et  al.,  1994;  Cieri  and  Stearns,  1999;  Hamrén  and  Hansson,  1999),  larval  cloning  in  echinoderms  (Vaughn,  2010),  colony  formation  and  cell  wall  thickening  in  phytoplankton  (for  a  review  see  Van  Donk  et  al.,  2011),  and  modification  of  shell  morphology  in  gastropod  veligers  (Vaughn,  2007).  The  studies  by  Vaughn  (2007,  2010)  are  the  only  two  examples  of  predator-­‐induced  morphological  changes  in  marine  larvae,  the  former  determining  that  veligers  of  Littorina   scutulata  developed  smaller  apertures  and  rounder  shells  when  exposed  to  cues  from  a  larval  decapod  predator,  zoeae  of  Cancer  spp.,  and  that  these  alterations  enhanced  survival.       The  occurrence  of  smaller  apertures  and  changes  in  shell  shape  are  well-­‐documented  in  benthic  examples  of  predator-­‐induced  defenses  of  both  marine  and  freshwater  adult  gastropods  (e.g.,  Kitching  and  Lockwood,  1974;  Appleton  and  Palmer,  1988;  Palmer,  1990;  DeWitt  et  al.,  2000;  Krist,  2002;  Cotton  et  al.,  2004;  Hoverman,  2007;  Rochette  et  al.,  2007;  Brönmark  et  al.,  2011;  Moody  and  Aronson,  2012;  Hoverman  et  al.,  2014).  One  additional  defense,  particularly  prevalent  in  marine  snails,  is  shell  thickening  (Kitching  and  Lockwood,  1974;  Appleton  and  Palmer,  1988;  Palmer,  1990;  Trussell,  1996;  Trussell  and  Smith,  2000;  Delgado  et  al.,  2002;  Trussell  and  Nicklin,  2002;  Dalziel  and  Boulding,  2005;  Brookes  and  Rochette,  2007;  Rochette  et  al.,  2007;  Lakowitz  et  al.,  2008;  Bourdeau,  2009,  2010a,  2010b,  2011,  2012;  Moody  and  Aronson,  2012;  Sepúlveda  et  al.,  2012;  Hoverman  et  al.,  2014).  The  thickened  shell  reduces  vulnerability  to  both  shell-­‐breaking  and  shell-­‐entering  predators  (e.g.,  Vermeij,  1974;  Hughes  and  Elner,  1979;  Palmer,    10   1979;  Bertness  and  Cunningham,  1981;  Palmer,  1985;  Bourdeau,  2009;  Covich,  2010;  Moody  and  Aronson,  2012).  Gastropod  veliger  larvae  are  known  to  be  able  to  survive  predation  attempts  utilizing  other  altered  features  such  as  spiral  sculpturing  or  changes  in  shell  shape  (Hickman,  1999;  Vaughn,  2007),  thus  it  is  plausible  that  an  inducibly-­‐thickened  shell  may  benefit  both  life  stages  of  the  snail  in  resisting  mechanical  damage.  However,  due  to  potential  complications  of  a  heavier  shell  in  a  planktonic  environment,  reinforcement  might  be  limited  to  regions  of  the  aperture  opening,  such  as  the  apertural  beak  or  velar  notches,  as  observed  in  a  variety  of  field-­‐caught  veligers  (Hickman,  1999).       The  composition  of  an  environmental  cue  can  influence  the  nature  of  the  induced  response.  This  has  been  investigated  extensively  in  the  inducible  traits  of  adult  snails  (e.g.,  Appleton  and  Palmer,  1988;  Palmer,  1990;  Trussell  and  Nicklin,  2002;  Bourdeau,  2010b).  Many  behavioral  plasticities  are  known  to  occur  in  response  to  injured  conspecifics  (alarm  cues;  e.g.,  Snyder,  1967;  Snyder  and  Snyder,  1971;  Atema  and  Stenzler,  1977;  Stenzler  and  Atema,  1977;  Alexander  and  Covich,  1991;  Vadas  et  al.,  1994;  Jacobsen  and  Stabell,  1999,  2004;  McCarthy  and  Fisher,  2000;  Grason  and  Miner,  2011).  Isolated  predator  kairomones  have  also  been  shown  to  elicit  behavioral  and  morphological  modifications  (Palmer,  1990;  McCarthy  and  Fisher,  2000;  Trussell  and  Nicklin,  2002;  Marko  and  Palmer,  1991;  Grason  and  Miner,  2011).  The  greatest  range/extent  of  morphological  and  behavioral  change  has  commonly  been  found  only  in  response  predators  consuming  conspecific  snails  (e.g.,  Alexander  and  Covich,  1991;  Krist,  2002;  Trussell  and  Nicklin,  2002;  Jacobsen  and  Stabell,  2004;  Bourdeau,  2010b).  This  combination  likely  provides  the  most  accurate  information  about  the  perceived  risk,  which  in  turn  influences  the  type  and  level  of  response  (e.g.,  Schoeppner  and  Relyea,  2005,  2009).  Others  studies  have  proposed  that  this  combined  signal  of  predators  and  injured  conspecifics  ‘labels’  the  predator  as  dangerous  and  that  this  information  is  able  to  persist  through  ingestion/digestion  where  it  can  be  detected  and    11   responded  to  post-­‐feeding  through  predator  excretions  (diet  cues;  see  Chivers  and  Smith,  1998  and  Ferrari  et  al.,  2010  for  reviews).       In  this  study,  we  sought  to  expand  our  understanding  of  how  different  types  of  predatory  treatments  (and  by  inference  the  composition  of  the  inducing  cues)  influence  the  shell  characteristics  of  veliger  larvae  of  L.  scutulata,  including  the  prospect  of  shell  reinforcement.  We  exposed  veliger  larvae  to  predators  that  had  been  raised  on  food  other  than  veligers,  to  predators  consuming  conspecific  veliger  larvae,  and  to  a  seawater  control.    Although  the  study  by  Vaughn  (2007)  tested  the  response  to  predators,  it  is  important  to  note  that  the  zoeae  used  in  her  predator  treatment  were  fed  veligers  of  L.  scutulata  prior  to  being  placed  in  the  experimental  cages;  therefore  it  is  possible  the  experimental  veligers  were  exposed  not  just  to  predator  kairomones,  but  to  post-­‐digestive  diet  cues  as  well.  Our  choice  of  treatments  allows  us  to  distinguish  the  specificity  of  responses  to  different  types  of  predatory  cues.  As  predators,  we  used  zoea  larvae  of  Hemigrapsus  nudus  because  zoea  larvae  of  Cancer  spp.  (used  by  Vaughn,  2007)  do  not  co-­‐occur  temporally  with  veligers  of   Littorina  spp.  in  Oregon  waters.  Zoea  larvae  of  Hemigrapsus  nudus  are  likely  to  be  encountered  by  the  veligers  in  Oregon  plankton,  are  in  the  same  crustacean  infraorder  (Brachyura),  are  easily  obtainable,  are  of  similar  size  to  those  used  by  Vaughn  (2007),  and  prey  on  veligers  of  L.  scutulata  via  the  aperture-­‐chipping  method  typical  of  many  zoea  larvae  (Hickman,  2001;  Vaughn,  2007;  J.  Valley,  personal  observations).     If  the  larvae  only  respond  to  or  respond  in  the  greatest  degree  to  the  treatment  of  predators  feeding  on  conspecifics,  this  will  indicate  the  usage  of  combinatory  information  such  as  is  often  seen  in  adults  that  would  likely  alert  the  larvae  to  both  conspecific  injury  as  well  as  provide  important  information  about  the  predator  and  its  pertinent  diet.  Context  specific  signals  such  as  the  ones  expected  in  this  treatment  are  thought  to  exist  so  that  prey  can  respond  variably  to  different  predators  with  different  predation  strategies  (e.g.,    12   crushing  vs.  peeling)  as  has  been  seen  in  both  behavioral  and  morphological  responses  in  a  variety  of  animals  such  as  adult  snails  (e.g.,  Turner  et  al.,  1999;  DeWitt  et  al.,  2000;  Hoverman  et  al.,  2005;  Bourdeau,  2009),  phytoplankton  (Long  et  al.,  2007)  and  vertebrates  (e.g.,  Relyea,  2001,  2003).         We  expected  veligers  to  respond  to  the  predator  only  treatment  and  to  respond  to  a  greater  extent  to  the  combinative  treatment  of  predators  consuming  conspecific  veliger  larvae.  We  also  expected  the  morphological  alterations  resulting  from  the  latter  treatment  to  enhance  survival  when  subjected  to  direct  predator  contact.  MATERIALS  AND  METHODS   Predator  collection  and  rearing     Adult  Hemigrapsus  nudus  (Dana  1851)  bearing  eggs  at  different  stages  of  development  were  collected  locally  from  the  boulder  fields  at  the  south-­‐side  of  Sunset  Bay  (43°20'1.99"N,  124°22'37.36"W)  or  from  the  rocky  shores  lining  Charleston  mudflats,  OR  (e.g.,  43°20'22.31"N,  124°19'5.87"W).  The  crabs  were  kept  submerged  in  glass  jars  equipped  with  an  air-­‐stone.  Upon  hatching  (usually  early  morning),  approximately  200  zoeae  were  placed  in  up  to  four  large  finger  bowls  depending  on  the  clutch  size.  The  fingerbowls  were  stacked  in  one  of  two  incubators  kept  at  either  18°C  or  13°C  to  hasten  or  slow  development,  thus  ensuring  a  steady  supply  of  zoeae  of  the  desired  stages  for  the  duration  of  the  study.  Every  other  day,  the  zoeae  were  moved  to  fresh  filtered  seawater  (FSW)  of  the  appropriate  temperature  and  were  fed  newly  hatched  Artemia,  a  tripartite  algal  mixture,  and  a  diluted  solution  of  artificial  plankton  (A.P.R.;  Ocean  Star  International,  Snowville,  UT)  filtered  through  100  μm  mesh.  At  this  time,  dead  zoeae  were  counted,  molts  noted,  and  a  portion  of  the  zoeae  was  staged.          13   Prey  adult  and  veliger  collection     Snails  in  the  genus  Littorina  (Gastropoda,  Caenogastropoda,  Littorinidae)  are  common  intertidally  worldwide  (McQuaid,  1996)  with  five  local  Oregon  species.  Three  of  these  species  (L.  scutulata  Gould  1849,  L.  plena  Gould  1849,  and  L.  keenae  Rosewater  1978)  exhibit  planktotrophic  development.  Snails  of  L.  scutulata  become  reproductively  mature  at  a  shell  height  of  2-­‐3  mm  and  the  reproductive  season  spans  from  early  April  to  early  October  (Strathmann,  1987;  Hohenlohe,  2002)  when  pelagic  egg  capsules  containing  varying  numbers  of  embryos  are  released.  Veligers  can  become  competent  to  settle  after  approximately  three  to  five  weeks  (Buckland-­‐Nicks  et  al.,  1973;  Hohenlohe,  2002;  J.  Valley  personal  observations).     To  obtain  veligers,  several  adult  L.  scutulata  collected  beside  the  jetty  at  OIMB  beach  (Charleston,  OR;  43°20'58.85"N,  124°19'49.50"W)  were  placed  in  screen-­‐bottomed  tricorner  plastic  beakers  suspended  in  FSW  overnight.  The  following  morning,  the  water  was  filtered  through  350  μm  mesh  and  egg  capsules  were  collected  and  distributed  into  large  glass  jars  filled  with  3L  FSW  for  a  concentration  of  ~200  veligers/L  upon  hatching.  During  and  following  the  ~eight  days  it  takes  the  veligers  to  develop  and  hatch  out  of  the  capsules,  the  ~13°C  water  was  changed  every  three  days  and  gently  stirred  by  paddles  suspended  from  a  motorized  stir  rack  (Strathmann,  1987).     Experimental  set-­‐up     Three  replicates  of  each  of  the  three  treatments  (isolated  predators,  P;  predators  feeding  on  conspecific  veligers,  PV;  and  control,  C)  were  randomly  distributed  in  each  of  two  sea  tables,  for  a  total  of  six  replicates  per  treatment.  The  daily  temperature  of  each  sea  table  was  ~13°C.  Each  replicate  consisted  of  a  Pyrex  1000  mL  beaker  containing  800  mL  FSW  and  50  newly-­‐hatched  veligers.  Floating  in  each  replicate  container  was  a  predator  cage  fashioned  out  of  a  50  mL  falcon  tube  with  100  μm  mesh  openings  on  the  sides  and    14   bottom  (Figure  2.1a).  Embedded  in  the  lid  of  the  cage  was  an  open-­‐bottomed  eppendorf  tube  with  a  sealable  lid.  With  this  lid  closed  water  was  retained  in  the  cage  and  zoeae  remained  submerged  whenever  the  cage  was  moved.  Just  beneath  the  lid  of  the  tube,  the  cage  was  outfitted  with  a  circle  of  foam  sheeting  (4  mm  thick)  to  allow  the  cage  to  float.  Five  stage  4  or  stage  5  zoeae  of  Hemigrapsus  nudus  were  placed  in  the  cages  of  the  six  P  and  PV  treatment  replicates.  Twenty  food-­‐veligers  (~one  week  old,  ~200  μm  shell  length)  were  also  added  to  the  cages  of  PV  replicates  for  the  zoeae  to  consume.  Every  three  days,  the  water  was  changed,  the  veligers  were  fed  a  tripartite  algal  mixture  (Isochrysis  galbana,   Dunaliella  tertiolecta,  Chaetoceros  gracilis)  of  equal  numbers  of  cells  at  a  combined  concentration  of  10,000  cells/mL,  and  the  treatments  were  renewed:  the  predators  were  removed  (dead  zoeae  and  molts  were  noted)  and  replaced  with  five  new  stage  4  or  stage  5  zoeae.  In  the  PV  replicates,  any  remaining  food-­‐veligers  were  counted  to  confirm  prey  consumption  and  replaced  with  20  new  food-­‐veligers  (~one  week  old).  After  four  weeks,  the  experimental  veligers  were  collected,  counted,  and  fixed  in  80%  ethanol  buffered  with  sodium  glycerophosphate  (Turner,  1976)  except  for  those  used  in  the  predation  trials  (see  below).       Predation  trials     The  greatest  response  was  expected  from  the  veligers  in  the  PV  treatment;  because  of  this  and  the  number  of  control  veligers  that  would  have  been  needed  to  test  both  PV  and  P  treatments,  the  predation  trials  only  used  veligers  from  the  PV  treatment.  The  methods  for  the  predation  trials  were  modeled  after  Vaughn  (2007).  Five  veligers  from  each  of  the  PV  and  control  replicates  were  randomly  selected  to  be  used  in  predation/survival  trials.  Half  of  these  30  PV  veligers  and  half  of  the  30  control  veligers  were  randomly  chosen  to  be  stained  for  one  hour  in  a  0.01%  solution  of  Neutral  Red.  The  veligers  were  then  randomly  assigned  to  one  of  two  combinations,  each  with  three  replicates.  The  first  combination      15     Figure  2.1.  The  cage  used  to  contain  the  treatment  cues  has  100  μm  mesh  windows,  a  float,  and  a  sealable  vent  to  contain  water  when  removed  (a).  The  shell  aspect  ratio  was  calculated  by  dividing  the  shell  length  (SL)  by  the  shell  height  (SH)  (b).  The  elliptical  area  of  the  aperture  was  estimated  using  the  aperture  length  (AL)  and  aperture  height  (AH)  (c;  solid  lines).  Marginal  reinforcement  was  estimated  using  the  average  perceived  thickness  of  the  aperture  margin  at  the  periphery  of  the  aperture  length  and  height  (c;  dotted  lines).  Scale  bars  =  100  μm.  ab  =  apertural  beak,  ap  =  aperture,  f  =  float,  op  =  operculum,  v  =  vent.    consisted  of  five  dyed  control  veligers  +  five  undyed  PV  veligers.  The  second  combination  consisted  of  five  dyed  PV  veligers  +  five  undyed  control  veligers.  Each  replicate  combination,  along  with  two  stage  5  zoeae  of  H.  nudus,  was  placed  in  a  randomly  assigned  well  in  a  six-­‐well  plate.  Every  30  minutes  for  3.5  hours,  the  number  of  dyed  vs.  undyed  veligers  in  each  well  was  counted.     Measurement  methods     To  measure  shell  length,  height,  and  aperture  area,  15  randomly-­‐selected,  fixed  veligers  from  each  replicate  were  individually  placed  in  the  tapered  base  of  a  severed  eppendorf  tube,  which  enabled  easy  manipulation  of  the  veligers  into  a  profile  position  that    16   minimized  the  angular  tilting  seen  when  placed  on  a  flat  surface  and  allowed  the  veliger  to  also  be  easily  positioned  aperture-­‐side  up.  The  veligers  were  photographed  and  measurements  from  these  images  were  later  collected  using  ImageJ  software  (NIH,  Bethesda,  MD).  Measurements  of  veliger  length,  height,  shell  aspect  ratio,  and  aperture  area  were  modeled  after  Vaughn  (2007).  Veliger  length  was  measured  as  the  largest  distance  from  the  tip  of  the  apertural  beak  to  the  opposite  side  of  the  shell  and  shell  height  was  measured  as  the  greatest  distance  perpendicular  to  shell  length  (Figure  2.1b).  A  shell  aspect  ratio  (SAR)  was  calculated  for  each  veliger  as  an  indication  of  overall  shell  shape  (length/height).  Aperture  area  was  estimated  using  the  formula  for  elliptical  area:  [(aperture  length  x  aperture  height  x  π)/4]  (Figure  2.1c).  The  marginal  reinforcement  measurement  consisted  of  the  average  perceived  thickness  of  the  aperture  margin  extending  from  either  end  of  the  aperture  length  and  height  measurements  (Figure  2.1c).  The  marginal  reinforcement  appears  to  be  a  combination  of  thickening  and  curving  of  the  apertural  edge.     Statistical  methods     An  ANCOVA  in  SPSS  was  used  to  test  the  effects  of  the  control  (C),  predator  (P),  and  predator  +  injured  conspecific  +  diet  cues  (PV)  scents  on  resulting  shell  shape  (SAR  =  shell  aspect  ratio;  shell  length/shell  height),  aperture  area,  and  marginal  reinforcement.  To  account  for  variance  due  to  size,  shell  height  was  included  as  a  covariate  as  it  was  not  affected  by  treatment.  There  was  no  interaction  between  treatment  and  the  covariate  for  any  of  the  dependent  variables  therefore  the  interaction  term  was  removed  from  the  models.  Subsequently,  graphical  inspection  and  data  analysis  indicated  no  statistical  effect  of  beaker  (p  ≥  0.362),  therefore  it  was  removed  from  the  models  and  all  individuals  within  each  treatment  were  pooled  (Quinn  and  Keough,  2002).  Normality  of  the  standardized  residuals  for  each  treatment  was  demonstrated  by  Shapiro-­‐Wilk’s  test,  homogeneity  of    17   variances  was  established  by  Levene’s  test,  and  all  residuals  were  homoscedastic.  Potential  outliers  were  determined  by  looking  for  standardized  residuals  greater  than  ±3  standard  deviations.  One  outlier  was  identified  in  the  marginal  reinforcement  data  but  was  left  in  because  its  removal  did  not  change  the  outcome  of  the  model.  Post-­‐hoc  analyses  were  performed  with  a  Bonferroni  adjustment.       Survival  of  veligers  from  the  control  treatment  and  from  the  PV  treatment  in  the  paired-­‐predation  trials  was  analyzed  using  a  life  tables  survival  analysis  in  SPSS.    RESULTS     Initial  pairing  of  different  zoeal  stages  with  various-­‐sized  veligers  of  L.  scutulata  showed  that  stage  3  zoeae  (~2.2  mm  total  length)  were  capable  of  capturing  and  consuming  medium-­‐sized  veligers  (~200  μm  shell  length)  and  stage  4  zoeae  (~2.6  mm)  were  capable  of  consuming  veligers  up  to  ~300  μm.  Stage  5  zoeae  (~3.3  mm)  were  capable  of  consuming  veligers  of  all  sizes.  As  has  been  described  for  other  zoea  predators  (Hickman,  2001;  Vaughn,  2007),  once  captured,  the  zoea  rolls  the  veliger  shell  to  where  it  can  commence  gradually  chipping  away  at  the  aperture  edges  until  the  larval  body  is  reached.  Evidence  of  veliger  consumption  can  be  seen  in  the  form  of  shell  fragments  on  the  bottom  of  the  dish.     There  was  a  significant  effect  of  the  covariate  (shell  height)  on  all  three  measured  variables  (p  <0.0005)  with  the  observed  trend  of  a  decrease  in  SAR  and  increases  in  aperture  area  and  marginal  reinforcement  as  shell  height  increased,  regardless  of  treatment.  Following  adjustment  by  shell  height,  there  was  a  statistically  significant  effect  of  treatment  found  for  SAR  (F2,  266  =  20.471,  p  <  0.0005),  aperture  area  (F2,  266  =  24.303,  p  <  0.0005),  and  marginal  reinforcement  (F2,  266  =  52.868,  p  <  0.0005]  (Table  2.1).  Post-­‐hoc  analyses  showed  that  veligers  from  the  P  group  had  a  significantly  smaller  SAR  (1.167  ±  0.004  SE)  than  veligers  from  either  the  control  (p  <  0.0005;  1.192  ±  0.004  SE)  or  PV  (p  <  0.0005;  1.188  ±  0.004  SE)  groups,  which  were  not  significantly  different  from  each  other  (p    18   =  0.108);  in  other  words,  veligers  raised  in  the  presence  of  predators  alone  developed  shells  that  were  significantly  more  round  than  those  raised  in  the  presence  of  predators  consuming  conspecifics  or  those  from  the  control  group  (Tables  2.1  and  2.2,  Figure  2.2).    Table  2.1.  Summary  of  statistical  results  including  ANCOVAs  with  post-­‐hoc  tests  (SAR,  aperture  area,  marginal  reinforcement)  and  life  tables  survival  analysis.    Variable    (df),  Test  Statistic   p  SAR    Control  vs.  P  Control  vs.  PV  P  vs.  PV   (2,  266),  F  =  20.471   <0.0005*  <0.0005*  0.108  <0.0005*  Aperture  Area    Control  vs.  P  Control  vs.  PV  P  vs.  PV   (2,  266),  F  =  24.303   <0.0005*  <0.0005*  <0.0005*  1.000  Marginal  Reinforcement    Control  vs.  P  Control  vs.  PV  P  vs.  PV   (2,  266),  F  =  52.868   <0.0005*  <0.0005*  <0.0005*  <0.0005*  Survival  (Control  vs.  PV)   (1),  W  =  4.104   0.043*    Table  2.2.  Summary  of  results  from  Vaughn  (2007)  and  the  present  study  for  veligers  raised  in  the  presence  of  predators  (P)  or  in  the  presence  of  predators  consuming  conspecifics  (PV).  SAR  data  are  shell  length/shell  height  (μm)  ±  SE.  Aperture  area  and  marginal  reinforcement  data  are  given  in  μm2  and  μm,  respectively,  ±  SE.  Variable  and  treatments   Vaughn  (2007)   This  study  SAR    Control  P  PV    1.16  ±  0.41  1.12  ±  0.321  n/a2    1.192  ±  0.004  1.167  ±  0.004  1.188  ±  0.004  Aperture  Area  Control  P  PV    21,151  ±  409.4  19,075  ±  288.01  n/a2    18,179  ±  127.1  17,042  ±  162.3  16,969  ±  184.6  Marginal  Reinforcement  Control  P  PV      n/a2    15.8  ±  0.2  16.7  ±  0.2  17.8  ±  0.2  1the  predator  kairomone  treatment  used  by  Vaughn  (2007)  may  have  also  included  diet  cues  (see  text).  2this  treatment  and  variable  was  not  included  in  Vaughn  (2007).    19    Figure  2.2.  The  relationship  between  shell  aspect  ratio  (SAR)  and  shell  height  for  veligers  raised  in  a  control  environment  (C),  in  the  presence  of  predators  (P),  and  in  the  presence  of  predators  consuming  conspecifics  (PV).  SAR  =  shell  length  (μm)/shell  height  (μm).  As  SAR  decreases,  the  shell  becomes  more  round.  P700  nm).  Ultraviolet  radiation  is  further  subdivided  into  UVA  (320-­‐400  nm),  UVB  (280-­‐320  nm),  UVC  (200-­‐280  nm),  and  vacuum  UV  (<  200  nm)  (e.g.,  Karentz,  1994).  By  the  time  it  reaches  earth’s  surface,  95%  of  ultraviolet  radiation  consists  solely  of  UVA;  the  majority  of  UVB  and  all  UVC  and  vacuum  UV  having  been  scattered  or  absorbed  by  atmospheric  gases  (e.g.,  ozone  and  nitrogen)  (de  Mora  et  al.,  2000;  Maverakis  et  al.,  2010).  Despite  this,  both  UVA  and  especially  the  remaining  UVB  directly  damage  DNA  and  various  proteins  and  also  indirectly  produce  equally  damaging  reactive  oxygen  species  (e.g.,  Vincent  and  Neale,  2000).     A C D B  105     Color  variation,  both  between  and  within  species,  is  common  in  shallow  water  echinoids  (e.g.,  Serafy,  1974;  Marcus,  1983;  Growns,  1989);  however,  the  relationship  between  light  exposure  and  urchin  phenotype  up  to  this  point  is  mostly  anecdotal.  Most  common  in  the  literature  is  the  well-­‐documented  shading  behavior  of  urchins  in  which  a  variety  of  materials  are  held  in  place  across  the  surface  of  the  urchin  by  tube  feet  (e.g.,  Lees  and  Carter,  1972).  This  is  most  often  attributed  to  protection  from  light  (e.g.,  see  Millott,  1975;  Adams,  2001;  Verling  et  al.,  2002),  although  several  other  factors  such  as  camouflage  or  protection  from  predators  (e.g.,  see  Millott,  1975;  Amsler  et  al.,  1999),  protection  from  surge  (Lees  and  Carter,  1972;  James,  2000;  Dumont  et  al.,  2007),  protection  from  desiccation/temperature  (e.g.,  see  Millott,  1975),  and  functions  related  to  feeding  (e.g.,  food  collection/storage:  Péquignat,  1966;  Dix,  1970;  Douglas,  1976)  have  been  proposed.  The  studies  by  Adams  (2001),  Verling  et  al.  (2002),  and  Dumont  et  al.  (2007)  showed  that  urchins  exhibit  significantly  greater  covering  behavior  in  response  to  UVA  and  UVB  radiation  than  to  PAR  alone.  A  study  by  Kehas  et  al.  (2005)  looked  at  the  difference  in  the  intensity  of  the  covering  response  between  normally  pigmented  wild-­‐type  Tripneustes   ventricosus  and  naturally-­‐occurring  albino  forms  and  found  that  the  albino  forms  covered  a  significantly  greater  proportion  of  their  aboral  surface  with  provided  material,  implying  that  the  lack  of  pigment  conferred  an  increased  susceptibility  to  the  harmful  effects  of  UVR.  Similar  results  were  found  between  the  less  pigmented  species  Lytechinus  variegatus  and  a  more  pigmented  species,  Arbacia  punctulata  (Sharp  and  Gray,  1962).  Covering  intensity  has  also  been  correlated  with  the  intensity  of  light  as  indicated  by  season  (e.g.,  Moore  et  al.,  1963)  and  time  of  day  (Millott,  1956;  Sharp  and  Gray,  1962).     Other  studies  have  observed  differences  in  color  both  between  and  within  species  correlating  either  with  geography  or  microhabitat  (e.g.,  Kristensen,  1964;  see  Anderson  et   al.,  1969;  Chesher,  1970;  Serafy,  1974;  Growns,  1989;  see  Kelly  et  al.,  2013,  etc.).  For    106   example,  urchins  of  Echinometra  mathaei  exhibit  four  distinct  morphotypes  whose  darkness  in  color  decreases  with  depth  (Nishihira  et  al.,  1991)  and  lighter  colored  urchins  of  Heliocidaris  erythrogramma  tend  to  be  found  under  rocks,  also  exhibiting  stronger  covering  behavior  than  the  darker  individuals  found  on  the  upper  surfaces  of  rocks  (Growns,  1989).  A  study  by  Kristensen  (1964)  showed  that  young  individuals  of  D.   antillarum  kept  in  the  dark  were  much  lighter  than  individuals  kept  in  ambient  light,  which  developed  the  typical  black  dermis  of  this  species  in  one  to  two  months;  this  color  difference  is  reflected  in  the  depth  range  of  this  species,  with  shallower  individuals  being  darker  than  ones  found  at  depth.     Urchins,  S.  purpuratus  in  particular,  represent  a  model  system  for  the  study  of  early  development.  They  are  also  models  for  studies  examining  the  effects  of  UVR  on  these  processes  and  on  the  animals  themselves,  with  the  majority  of  work  done  on  embryos  and  larvae  (Lamare  et  al.,  2011).  Collectively,  the  protective  strategies  identified  for  echinoderms  against  UVR  include  behavioral  avoidance,  repair  of  damaged  DNA,  proteins  or  lipids,  mitigation  of  oxidative  stress  (e.g.,  through  the  use  of  antioxidants),  and  the  production  of  UVR-­‐absorbing  compounds  (Lamare  et  al.,  2011).       Of  a  variety  of  compounds  known  to  directly  and/or  or  indirectly  provide  protection  from  UV  radiation,  there  are  at  least  three  known  to  occur  in  urchins:  carotenoids,  mycosporine-­‐like  amino  acids  (MAAs),  and  naphthoquinones.       Carotenoids  are  widespread  lipid-­‐based  pigments  known  to  act  as  protectants  against  the  effects  of  UV  radiation.  They  function  as  sunscreening  agents,  deal  with  UV-­‐induced  oxidative  stress  (e.g.,  as  antioxidants  or  free  radical  scavengers),  and  help  to  dissipate  excess  energy  (e.g.,  Britton,  1983;  Edge  et  al.,  1997;  Mathews-­‐Roth,  1997;  Rastogi   et  al.,  2010;  Dahms  and  Lee,  2010).  Exposure  to  UVR  has  been  shown  to  stimulate  enhanced  production  of  carotenoids  in  cyanobacteria  (e.g.,  Ehling-­‐Schulz  et  al.,  1997),  phytoplankton    107   (e.g.,  Barlow  et  al.,  2007),  fungi  (e.g.,  Libkind  et  al.,  2004),  plants  (e.g.,  Merzlyak  and  Chivkunova,  2000),  and  macroalgae  (e.g.,  Lee  and  Shiu,  2009);  however,  animals  cannot  produce  carotenoids  and  must  obtain  them  through  their  diet  (Moeller  et  al.,  2005).  Most  research  concerning  carotenoids  and  urchins  has  been  focused  on  the  gonads,  where  the  highest  concentrations  are  generally  found  (e.g.,  see  Kelly  and  Symonds,  2013).  A  study  done  by  Lamare  and  Hoffman  (2004)  was  able  to  correlate  higher  sensitivity  to  UV  radiation  with  decreased  levels  of  carotenoids  in  the  eggs  of  four  species  of  urchins,  including  S.   purpuratus.  At  least  six  different  carotenoids  have  been  isolated  from  S.  purpuratus  (Fox  and  Scheer,  1941;  Griffiths,  1966;  Lamare  and  Hoffman,  2004),  although  the  only  study  not  focusing  on  eggs/gonads  only  found  traces  of  carotenoids  in  the  skin  (Fox  and  Scheer,  1941).     Mycosporine-­‐like  amino  acids  (MAAs)  are  small  colorless  compounds  with  strong  absorption  maxima  occurring  in  both  UVA  and  UVB  wavelength  ranges  and  are  widely  accepted  as  photoprotective  compounds  (e.g.,  Singh  et  al.,  2008;  Rastogi  et  al.,  2010;  Dahms  and  Lee,  2010).  Produced  in  response  to  UV  radiation  in  many  algae,  phytoplankton,  and  cyanobacteria  (e.g.,  Singh  et  al.,  2008;  Rastogi  et  al.,  2010;  Rastogi  and  Incharoensakdi,  2014),  primary  and  secondary  consumers  can  selectively  incorporate  these  compounds  from  their  diet  (e.g.,  Carroll  and  Shick,  1996;  Whitehead  et  al.,  2001;  Adams  et  al.,  2001;  Gravem  and  Adams,  2012).  Although  much  work  has  been  done  looking  at  MAAs  in  echinoderms,  only  in  tropical  holothurians  has  a  high  concentration  been  found  in  the  epidermis  (e.g.,  Shick  et  al.,  1992;  Bandaranayake  and  Rocher,  1999).  In  urchins,  the  largest  concentrations  found  have  been  in  the  ovaries  with  only  small  to  trace  amounts  in  the  body  wall  (e.g.,  Carroll  and  Shick,  1996;  Karentz  et  al.,  1997;  McClintock  and  Karentz,  1999;  Gravem  and  Adams,  2012).  The  explanation  for  this  is  that  embryos  and  larvae  are  more  vulnerable  to  UVR  near  the  water’s  surface  than  the  benthic  adults.  Even  though  a  large    108   portion  of  UVR  is  reflected  at  the  water  surface  or  scattered/absorbed  in  the  water  column,  UVB  and  UVA  can  still  penetrate  to  depths  greater  than  16  m  and  46  m,  respectively  (e.g.,  Tedetti  and  Sempéré,  2006),  well  within  the  depth  range  inhabited  by  many  intertidal  urchins.  Urchins  of  S.  purpuratus  inhabit  a  range  of  0  to  90  m  but  are  most  common  in  the  mid  to  low  intertidal  where  they  are  frequently  in  shallow-­‐water  or  air-­‐exposed  for  hours  at  time  during  low  tides  (e.g.,  Farmanfarmaian  and  Giese,  1963;  Pearse  and  Mooi,  2007;  personal  observations).  Although  Gravem  and  Adams  (2102)  did  find  some  association  between  epidermal  MAA  content  and  microhabitat-­‐dependent  sun  exposure,  the  amounts  of  MAAs  in  the  epidermis  of  S.  purpuratus  were  relatively  small  compared  to  gonadal  levels  and  to  reported  levels  of  MAAs  in  other  echinoderms  in  general.  What  then,  if  not  carotenoid  or  MAA  pigments,  is  primarily  protecting  these  urchins  from  the  sun?         The  color  of  echinoids  is  attributed  primarily  to  the  production  of  polyhydroxylated  1,  4-­‐naphthoquinones,  a  type  of  quinone  pigment  (e.g.,  Goodwin,  1969;  Anderson  et  al.,  1969;  Grossert,  1972;  Needham,  1974;  Fox,  1976;  Britton,  1983)  with  the  exception  of  some  irregular  urchins,  whose  color  is  largely  due  to  the  presence  of  carotenoids  with  or  without  naphthoquinones  (Kawaguti  and  Yamasu,  1954;  Tsushima  and  Matsuno,  1990).  Quinones,  also  found  in  lichens,  fungi,  higher  plants,  and  arthropods,  are  well  known  for  their  light-­‐absorption  properties,  with  at  least  one  absorption  maximum  commonly  occurring  in  UVR  wavelengths  (Spruit,  1949;  Britton,  1983).  The  different  forms  of  1,4-­‐naphthoquinones  found  in  echinoderms  have  traditionally  been  referred  to  as  echinochromes  and  spinochromes  (e.g.,  Fox,  1976;  Needham,  1974;  Britton,  1983).  Echinochrome  A,  first  described  by  MacMunn  (1885),  can  be  found  both  in  soft  tissues  and  coelomic  fluid  (primarily  within  red  spherule  cells;  e.g.,  Johnson,  1969;  Smith  et  al.,  1992;  Johnstone,  2013)  and  calcareous  parts  (test  and  spines).  Spinochromes  are  found  only  in  the  test  and  spines    109   in  the  form  of  calcium  salts  (e.g.,  Goodwin  and  Sriusukh,  1950;  Goodwin,  1969;  Anderson  et   al.,  1969;  Britton,  1983).       In  the  past,  naphthoquinones  have  been  suggested  to  function  in  respiration  (see  Tyler,  1939),  in  photoreception  (e.g.,  Millot  and  Yoshida,  1957),  as  algistats  (Vevers,  1963,  1966;  Kittredge,  1971),  or  as  antimicrobial  agents  (Johnson,  1969;  Johnson  and  Chapman,  1970a,  1970b;  Service  and  Wardlaw,  1984;  Gerardi  et  al.,  1990;  Haug  et  al.,  2002).  Naphthoquinones  are  known  to  act  as  valuable  antioxidants  by  scavenging  harmful  free  radicals,  as  do  carotenoids,  and  by  chelating  iron  (Lebedev  et  al.,  2005;  Kuwahara  et  al.,  2009;  Zhou  et  al.,  2011;  Li  et  al.,  2013;  Pozharitskaya  et  al.,  2013;  Powell  et  al.,  2014).  A  minimum  of  four  naphthoquinone  pigments  including  echinochrome  A  and  spinochromes  A,  B  and  E  have  been  found  in  S.  purpuratus,  all  of  which  have  been  shown  to  have  absorption  maxima  in  the  UVA/UVB  range  (Goodwin  and  Srisukh,  1950;  Griffiths,  1965;  Anderson  et  al.,  1969;  Kuwahara  et  al.,  2009,  2010;  Zhou  et  al.,  2011;  Powell  et  al.,  2014).  Despite  the  existence  of  persistent  correlative  evidence  linking  UVR  protection  and  naphthoquinone  pigments  in  urchins,  a  recent  review  of  the  history  of  UVR  and  echinoderms  made  no  mention  of  it  (Lamare  et  al.,  2011).  Due  to  their  ability  to  absorb  UVR  and  antioxidant  properties,  it  is  very  likely  that  the  production  of  naphthoquinone  pigments  may  protect  urchins  against  UVR  exposure  (e.g.,  Powell  et  al.,  2014).       The  induction  of  UVR-­‐absorbing  compound  production  or  accumulation  in  response  to  UVR  with  a  corresponding  decrease  in  susceptibility  to  damage  is  a  widespread  phenomenon,  occurring  in  cyanobacteria  (e.g.,  Ehling-­‐Schulz  et  al.,  1997;  Rastogi  and  Incharoensakdi,  2014),  nematodes  (Baker  et  al.,  2012),  crustaceans  (e.g.,  Hansson,  2000;  Hansson  et  al.,  2007;  Hylander  and  Hansson,  2013),  plants  (e.g.,  Chalker-­‐Scott,  1999;  Merzlyak  and  Chivkunova,  2000;  Zu  et  al.,  2010;  Ji  et  al.,  2016),  fish  (see  Leclercq  et  al.,  2010),  snails  (Ahlgren  et  al.,  2013),  and  humans  (e.g.,  Friedmann  and  Gilchrest,  1987;    110   Miyamura  et  al.,  2006;  Costin  and  Hearing,  2007),  to  name  a  few.  The  study  by  Kristensen  (1964)  demonstrated  light-­‐induced  pigment  production  in  Diadema  antillarum  but  the  light  was  ambient  and  not  specifically  UVR,  and  consequent  susceptibility  to  UVR  was  not  determined,  although  the  photoprotectant  qualities  of  melanin  (this  urchin’s  primary  pigment)  are  well  established  (e.g.,  Friedmann  and  Gilchrest,  1987;  Kollias  et  al.,  1991;  Gilchrest  et  al.,  1995;  Costin  and  Hearing,  2007).  Based  on  the  variation  in  color  of  juvenile  urchins  of  S.  purpuratus  depending  on  local  microhabitat,  we  hypothesized  that  light,  specifically  ultraviolet  radiation,  is  the  link  between  habitat  and  color  in  juvenile  urchins  of  this  species  and  that  the  production  of  pigment  is  a  phenotypically  plastic  protective  response  to  light  exposure.       To  test  the  role  of  UVR  in  urchin  coloration,  juvenile  Strongylocentrotus  purpuratus  of  the  green  variety  were  collected  from  the  field  and  kept  under  ambient  solar  radiation,  ambient  solar  radiation  filtered  of  UVR,  or  in  the  dark  for  ~three  months.  Pigment  production  was  monitored  over  time  via  photographic  assessment  of  a  purple:green  ratio  and  at  the  end  of  the  study  by  a  spectrophotometric  measure  of  dermally  extracted  echinochrome  levels  with  the  expectation  that  UV  radiation  will  produce  purple  urchins  with  a  higher  amount  of  pigment  while  urchins  isolated  from  UV  radiation  will  remain  green  in  color  (indicating  less  pigment).  Cost  of  pigment  production  was  evaluated  by  measuring  changes  in  test  size  and  spine  length.  In  order  to  test  the  hypothesis  that  the  production  of  pigment  confers  reduced  susceptibility  to  damage  by  UVR,  righting  time  and  tube  foot  extension  of  urchins  was  measured  following  exposure  to  elevated  UVA  and  UVB  radiation  at  the  end  of  the  study.  To  ensure  characteristics  of  urchins  resulting  from  the  rearing  study  were  representative  of  color  variants  grown  in  the  field,  this  assay  was  repeated  for  field-­‐collected  green  and  purple  variants.  The  tube  feet  also  exhibit  differences  in  color  and  presumptive  pigment  levels  both  between  and  within  individuals  (Figure  5.2);    111   paler  tube  feet  found  on  individuals  collected  from  the  sheltered  boulder-­‐field  habitat  are  expected  to  contain  less  pigment  than  the  darker  tube  feet  found  on  individuals  from  the  light-­‐exposed  urchin  pits.  Since  urchins  from  the  exposed  pit  environment  are  always  oriented  aboral-­‐side  up  and  appear  to  have  lighter-­‐colored  tube  feet  on  the  more-­‐sheltered  oral  side,  we  also  hypothesized  that  there  would  be  a  difference  in  pigment  levels  of  tube  feet  from  the  aboral  vs.  oral  sides  of  purple  urchins  but  that  there  would  no  difference  in  pigment  levels  between  the  aboral  and  oral  sides  of  the  generally  sheltered  green  urchins.      Figure  5.2.  Green  and  purple  juveniles  displaying  differences  in  overall  color  and  in  the  amount  of  pigment  located  in  the  dark  podia  of  purple  juveniles  and  in  the  relative  lack  of  pigment  in  the  light  podia  of  green  juveniles.  Scale  bar  =  10  mm.     MATERIALS  AND  METHODS   Rearing  study  set-­‐up     Twenty-­‐four  juvenile  green  urchins  of  Strongylocentrotus  purpuratus,  ~2  cm  in  test  diameter,  were  collected  in  late  March,  2014,  from  the  underside  of  large  rocks  in  an  intertidal  boulder  field  at  Cape  Arago,  Oregon  (43°18'13.73"N,  124°24'3.09"W;  Figure  5.1C).  The  urchins  were  kept  in  opaque  containers  in  running  seawater  until  the  start  of  the  study,  not  exceeding  one  week.    112     These  urchins  were  randomly  assigned  to  flow-­‐through  containers  covered  with  different  acrylic  panels  giving  three  different  light  treatments:  dark  (opaque  cover  -­‐  no  light),  -­‐UV  (OP3  cover  –  allows  PAR  but  blocks  98%  UVR),  and  +UV  (OP4  cover  –  allows  PAR  and  UVR).  The  OP3  and  OP4  acrylic  panels  are  manufactured  by  CYRO  industries  (Parsippany,  NY).  There  were  eight  replicates  per  treatment.  The  urchins  were  individually  kept  in  small,  plastic  containers  with  plastic-­‐mesh  bottoms  and  sides.  The  central  portion  of  the  container  lid  was  cut-­‐out,  leaving  only  the  locking  rim  of  the  lid,  the  top  of  which  was  glued  to  the  underside  of  the  appropriate  type  of  acrylic  panel.  This  container  sat  within  a  larger  opaque  container  with  an  opening  for  a  small  hose  providing  individual  water  flow  and  a  hole  in  the  bottom  where  water  and  waste  could  exit  (Figure  5.3A).  The  containers  were  suspended  in  an  outdoor  sea  table  lined  with  opaque  black  plastic.  This  set-­‐up  was  designed  primarily  to  completely  restrict  the  light  encountered  by  the  urchins  to  that  which  did  or  did  not  enter  from  above  (dependent  on  the  acrylic  panel  type)  and  to  restrict  any  leakage  of  light  between  adjacent  treatments.  Every  third  day  the  set-­‐up  was  cleaned  and  the  urchins  were  fed  uniformly  sized  pieces  of  Ulva  sp.  Although  urchins  sometimes  initially  held  the  food  over  their  aboral  surface,  the  algae  was  always  eaten  or  pulled  underneath  within  one  hour  after  presentation.  Other  than  very  brief  exposures  during  set-­‐up,  cleaning,  and  transportation  indoors  for  photography  (<  15  seconds  of  outdoor  conditions),  and  during  photography  (